Smeltcurve data-analyse

Snuffel

Mijn excuses, weet niet echt waar ik deze topic moet plaatsen..

Nu ik bezig ben met de qPCR is er van een aantal monsters een smeltcurve bepaald, natuurlijk wil ik graag weten of deze monsters primer-dimeren vormen of dat er ook daadwerkelijk PCR product is geamplificeerd.

De primer die gebruikt is TH01 met zijn Tm-waarden: A-> Tm=62 en B->Tm=79

- Nu heb ik een grafiek gekregen waarvan meerdere monsters eendezelfde piek vertonen, deze ligt bij een melttemperature van 77,0.

- 1 monster geeft een piek bij 74,50

- een andere monster een piek bij 75,0

Ik weet niet hoe ik deze data kan analyseren, kan iemand mij op weg helpen?

Is dit voldoende informatie? Of moet ik nog meer data verschaffen?

Gegroet, Snuffel

Mrtn

Het zou ideaal zijn als je de grafiek kan plaatsen

Dé functie van de melt curve is het kunnen onderscheiden van verschillende producten met verschillende Tm, al dan niet in één reactie. Als je nog meer rt/qPCR reacties uitvoert zou je eens een monster kunnen 'besmetten' met een ander DNA sample en/of een primer waarvan je weet dat er dimers zullen ontstaan. Je zult dan één grafiek vinden met meerdere toppen: verschillende Tm voor verschillende producten. In je andere grafiek vind je immers alleen maar het totaal aan PCRproduct, wat het ook moge zijn.. als het fluoresceert is het al goed genoeg voor in die grafiek.

Je smelt curve is dus een check om te zien hoe specifiek je PCR verlopen is: een indicatie of de temperaturen in je cyclus goed zijn, of de buffer voldoet, etc. Lang verhaal kort: of de condities goed (genoeg) zijn, etc. Het is een manier om te zien of je PCR an sich in orde is en wat er aan verschillende producten is ontstaan.

Snuffel

En toen wist ik niet hoe ik een grafiek kan plaatsen :s

Mrtn

Gelukkig hebben we daar een "Help" voor geschreven

Helemaal rechtsboven in je scherm, in de blauwe balk.

Heb je wat aan de antwoorden die je tot nu toe hebt?

Snuffel

Hoop dat het zo lukt!

Grafiek smeltcurve:

http://www.fotopocket.nl/fpimages/2009/05/...e1_19-05-09.bmp

Gegevens smeltcurve:

http://www.fotopocket.nl/fpimages/2009/05/...Tm_19-05-09.bmp

Ik hoop echt dat iemand mij kan helpen.

Alvast bedankt!

Groet, Snuffel

Mrtn

Even een voor een de boel uit elkaar pluizen.

Je hebt een primerset met Tm = 62 en 79 C. Die pieken zijn niet terug te vinden in je smeltgrafiek en dus heb je geen dikke bende aan primer dimers. Anders had je een product gevonden met die smelttemp.

Vraag jezelf af: kan je primers vermenigvuldigen met PCR? Zit er een label aan je primer? Detecteer je de primers wel met deze techniek?

Al heb je primer dimers, dan nog denatureren deze gewoon bij je 94-96 graden stap om van de boel weer ssDNA te maken.

Dan..

Je hebt een aantal monsters met dezelfde Tm (77 C). Wat zat er in die reacties?

Zelfde primersets? Wat zat er aan DNA in?

Wat verwachtte je te zien?

Probeer een volgende keer wat vollediger te zijn: zonder dat we weten wat er in de reacties zit, kunnen we er nog weinig over zeggen.

Het ziet er qua Tm uit als hetzelfde product. Alleen is een lagere piek een teken van minder product. Dat zou je in je andere grafiek moeten kunnen terugzien: die komen later op en komen niet zo mooi in de plateau-fase als de monsters met de hogere pieken dat doen (je meet immers fluorescentie, een maat voor hoe veel product er precies is: de essentie van deze techniek).

Snuffel

Je mag dus concluderen als je geen pieken ziet die voldoen aan je smelttemperaturen van je primers, dan heb je geen primer dimeren? *Dit was mij niet helemaal duidelijk, ik wist niet of ik dit wel mocht concluderen* En heb ik dus product? Al kan het nog steeds a-specifiek zijn?

In D789 zit tussen de 80 en 90 ng DNA (geisoleerd uit bloed met de Chelex-methode), de SYBR-green supermix en de primer TH01 (120 pmol van forward en reverse=12 ul van 10pmol/ul)

Maar ik mag dus zeggen dat ik product heb en geen primer dimeren? Hoe zit het met de 2 grafieken die iets afwijken van de meeste grafieken bij 77C?

Een reden voor het gebruik van qPCR is dat er geen bandjes te ontdekken (elektroforese) waren na "gewone" PCR met dezelfde primer. Wel waren er bandjes te ontdekken die lager uitkwamen dan het laagste markerbandje van 50 bp, dus dacht ik dat deze primer dimeren waren..

Mrtn

Niet om nou vervelend te gaan zitten doen, maar je moet wel lezen wat ik opschrijf. En de vragen die ik erbij stel staan er niet voor niets, bijvoorbeeld: verwacht je dat primers fluoresceren met deze techniek? En kan je primers vermenigvuldigen met PCR?

Geen bandjes op een gel?

Wat voor een gel, hoe lang heeft hij gelopen op welke spanning en hoe groot verwacht je dat je PCR product precies is? Onder het 50bp bandje van de marker een bandje gevonden, dat kan inderdaad een primer dimer zijn. Het zou kunnen dat je PCR gewoon niet optimaal is verlopen door ..sja, kan vanalles zijn: een verkeerde Ta of een gevriesdooid Taq gebruikt, of gewoon iets vergeten toe te voegen in je mastermix misschien? Dat soort dingen overkomt de besten

Heb je een PCR machine tot je beschikking met een temperatuur gradiënt in het blok? Dan kan je vrij gemakkelijk spelen met de Ta bijvoorbeeld.

D7, 8 en 9 is gewoon een triplo dus? Of heb je bewust andere hoeveelheden DNA toegevoegd?

Zelfde DNA (eventueel andere hoeveelheid), zelfde primerset = je verwacht hetzelfde product voor alle drie.

Wat je met deze gegevens kan zeggen is dat je één specifiek product hebt (want je hebt maar één piek in de smeltcurve) met een zekere Tm (77 C). Je weet wat je primers voor een product vormen en je kan daar een Tm van voorspellen. En loop je producten toch altijd nog even op een gel om na te gaan of je naar het goede product zit te kijken. Als de primerset dan eenmaal bewezen is op dit DNA, hoef je die gel niet meer elke keer te laten lopen.

Kanttekening hierbij is overigens dat het niet ondenkbaar is dat er een tweede product vormt met dezelfde Tm, maar dat is niet gebruikelijk. Wel is het netjes om dat uit te sluiten met een gel elektroforese.

Je vraagt wat er met die twee andere grafieken is, die iets afwijken in Tm. Maar je verteld niet wat je erin hebt gestopt en wat je verwacht.

Wouter_Masselink

Een kanttekening in het verlengde van Mrtn, als je op gel geen product aantreft en wel product waarneemt bij je qPCR, dan vermoed ik dat je niet dezelfde procedure hebt gevolgt. Het beste, naar mijn mening, is om een qPCR uit te voeren en op het einde van deze qPCR, je producten direct op gel te zetten. Deze zouden dan specifiek bandjes moeten geven.

De verschillende hoogte in pieken zou je terug moeten zien als een verschil in intensiteit van je bandjes op gel. Verder duiden pieken met een verschillende T<sub>m</sub> vaak op een verschil in lengte of G/C content van je product,het verschil in G/C content zou je niet op gel terug kunnen zien, een verschil in lengte wel.

Mocht je deze resultaten telkens zien en er verder niet uitkomen dan zou het kunnen helpen om je producten te sequencen. Gebruik hierbij wel andere primers dan je huidige primers, aangezien je anders niet je hele verwachte sequentie terug zal vinden.

Snuffel

Hoi!! Bedankt voor jullie reacties

Met dit bericht enkele nieuwe gegevens:

Instellingen qPCR

- 4,5 min 95 C

- 40x Cycli:

Mrtn

Ehm, dat zegt niet zo veel. De temperatuur van je denaturatie stap is eigenlijk niet interessant want die is vrij standaard en heeft niet zo veel invloed op het gehele proces. De Ta is veel belangrijker voor de stringentie van het hele verhaal.

Nogmaals, niet om nou vervelend te willen doen maar ik probeer je te helpen door je een aantal vragen te stellen en daar geef je gewoon geen antwoord op. Wat verwacht je precies dat we doen / hoe we je verder helpen?

Snuffel

Haha! Ik had op tab en een keer op Enter gedrukt, ik wilde het bericht editen *daar was ik mee bezig* en dit gaf een error, sorry maar ik ben niet zo snel met typen, ik probeer met dit bericht *wat ik dus al aan het typen was

* antwoorden op je vragen te geven, ik ben blij dat jullie me al zo snel helpen, maar ik weet het simpelweg niet meer, daarom zette ik deze smeltcurve op het forum

Sorry dat ik misschien dom klink, maar wat is het verschil tussen Ta en Tm?

Instellingen qPCR

- 4,5 min 95 C

- 40x Cycli: 45 sec 94 C

45 sec 55 C

45 sec 72 C

- 10 min 72 C

- Smeltcurve bepaling 55 -> 95,5 C (in 81 cycli)

In de SYBR green supermix zitten de volgende componenten:

100 mM KCl, 40 mM Tris-HCI, pH 8.4,

0.4 mM of each dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),

iTaq DNA polymerase,

50 units/ml, 6 mM MgCl2, SYBR Green I,

20 nM fluoresein, and stabilizers.

Hier hoeven dus nog alleen maar de primers worden toegevoegd, dit is dan primer TH01. Er zal geen vermenigvuldiging plaatsvinden van de primers, dit kan toch niet, omdat deze primers eerst aan ssDNA moeten binden en die daarna verlengd wordt door de Taq? Primers fluoresceren niet, SYBR green fluoresceert alleen bij dsDNA, of bij nieuw ontstaan product (specifiek als de primers werken, a-specifiek als de primers mismatchen) Voor iedere monster is dezelfde primerset gebruikt, wel zijn er andere soorten monsters (DNA is wel elke keer uit bloed geisoleerd) gebruikt met verschillende hoeveelheden, kunnen verschillende soorten monsters wel dezelfde pieken geven? Wel als hetzelfde bloed is gebruikt, dan is dit wel mogelijk, toch? (zie onderaan welk epje wat in zit)

Ook vervelend is dat de primer TH01 in humaan DNA bepaalde allelnummers weergeeft, zoals bijna bij elke primer in het genoom DNA, het verschil in allelen geeft dus ook een verschil in grootte van het product, moet ik dan van elke mogelijke allelcombinatie de grootte berekenen en hiervan de Tm bepalen?

Het kan zijn dat er bij de "normale" PCR inderdaad een fout is gemaakt bij het pipetteren of dat er een essentieel component vergeten is, daarom is zo supermix bij de qPCR wel handig, omdat je hiervan uit mag gaan dat hier "alles" in zit, maar het is ook duurder en kan er niet zoveel gebruik van worden gemaakt.

E4= Normaal isolaat 41 ng

E5= 49 ng (bewerkt met chemicalien)

E6= 29 ng (bewerkt met chemicalien)

D4= 45 ng (bloed onder UV licht)

D5= 34 ng (bloed zonder licht)

D6= 34 ng (bloed onder TL-lamp)

Producten sequencen is geen optie, op gel brengen na een qPCR-run is wel mogelijk! Mijn excuses voor het te snel reageren vorig bericht, ik was al blij dat iemand reageerde op mijn topic. Ik vind het zelf best moeilijk en het is zeer frustrerend, omdat het niet wil lukken. Ik zou graag willen weten wat ik met mijn smeltcurve kan concluderen of dat het niks waard is, omdat ik deze producten niet op gel heb gebracht..

Wil jullie bedanken voor de snelle en informatieve antwoorden

Mrtn

Ok, kijk.. dát is een antwoord

Sorry voor mijn ongeduld in de vorige post.

Even zien..

Laten we beginnen met: Ta is de temp waarop de primers aan het gedenatureerde DNA hechten (de a is voor annealing). De Tm is de Temperature-melt, de temperatuur waarop je gevormde product denatureert. Die temp zegt wat over de lengte en GC content van je PCR-product en dat kan je gebruiken voor het onderscheiden van verschillende producten in één epje.

Nooit meer zeggen dat een vraag stellen misschien dom klinkt. Zoals onze Jan altijd zegt: het is pas dom om de vraag niet te stellen

Je lijkt de essentie van de techniek aardig te pakken te hebben. Primers horen inderdaad niet te vermenigvuldigen en ook zie je ze niet terug in je melt curve (dimers misschien wel maar dan moet je er wel verdomd veel van hebben en zo veel primer voeg je normaal niet toe). Het lijkt wel of je de waarde van de smeltgrafiek een beetje overschat. Eén piek is vrijwel zeker één product en als die Tm ongeveer klopt (40 graden zou raar zijn) en je hem elke keer dat je de PCR herhaalt op dezelfde temp ligt, is het prima. Als je zeker wil weten of de Tm die je vindt in je grafiek hoort bij het product dat je verwacht, zou ik op gel kijken of de lengte klopt.

Je vraagt:

kunnen verschillende soorten monsters wel dezelfde pieken geven? Wel als hetzelfde bloed is gebruikt, dan is dit wel mogelijk, toch?

Zolang het DNA en de primerset voor ieder monster gelijk is: ja want hetzelfde DNA en dezelfde primer geeft hetzelfde product. Zo simpel kan het zijn

Lang verhaal kort: je hebt een mooie smeltcurve en geen reden om aan te nemen dat je aspecifieke rommel in je epje hebt. Op gel zetten om dat te bevestigen dus. Hoe groot is het product dat je verwacht? Pas daar je gel op aan (40bp niet op een 0,8% gel zetten en omgekeerd: 5kb niet op een 4% gel laten lopen).

Je andere grafiek zegt je iets over hoe veel product er gevormd is en belangrijker voor q-RT PCR: met hoe veel DNA je begon. Dat is voor jou dus niet zo relevant geloof ik omdat het je gewoon om de PCR gaat als ik het goed begrijp (de gewone PCR werkte niet).

Je vraagt naar het allel waar je naar zoekt: Human tyrosine hydroxylase ?

Er zijn verschillende varianten van, dat klopt maar waar zoek je precies naar dan en waarom heb je gekozen voor deze primers? Wat wil je PCR'en en wat wil je daar dan mee gaan doen? Wat is de functie van de verschillende behandelingen van het bloed?

Ik snap nog niet zo goed wat het doel van het hele verhaal is..

Snuffel

Er is gekozen voor de primer TH01, omdat deze gebruikt wordt in de forensische wereld. (je moet toch ergens beginnen) De onderzoeksvraag is, het effect van milieufactoren op de degradatie van DNA in bloed. Aan het begin moet er dus een bandje aangetoond worden, en kijken of er bij andere monsters die bewerkt zijn ook dit bandje te vinden is. Als dit bandje er niet meer is, dan blijkt het DNA zo gedegradeerd te zijn dat er geen volledig DNA profiel gemaakt kan worden, dit was de bedoeling, maar het lijkt niet verder te komen dan PCR en het troubleshooten ervan, en kan het doel waarschijnlijk niet behaald worden. Het is erg frustrerend en jammer dat een leuk onderzoek niet afgerond kan worden. Er wordt volgende week een normale PCR ingezet, misschien ook wel een qPCR (zie de kans klein).

Owjah, het product heeft een grootte van tussen de 150-220 bp, dus een hoge % agarosegel wordt gebruikt (2% of 3%)

Stel dat er een qPCR wordt uitgevoerd, moeten deze monsters dan nog verzwaard worden met 6x agarosegel loading buffer? En volgens mij hoeft er dan geen EtBr in de gel te zitten, omdat de producten SYBR green bevatten, is dit juist of is deze gel dan niet onder de UV-bak te leggen?

Nog any tips voor het afronden of voor de "normale" PCR?

Bedankt dat je me zo snel en goed helpt

Mrtn

Om maar even te beginnen: dit hoort ook bij wetenschap! Helaas krijg je niet altijd de resultaten die je zoekt maar vergeet niet dat je met troubleshooten kan laten zien wat je waard bent. En daar ben je nu mee bezig.. niet uit het veld laten slaan hoor

Waarom gebruik je in vredesnaam een gewone PCR om aan te tonen of DNA deels afbreekt onder invloed van omgevingsfactoren? Helemaal als je alles voor een qRT PCR tot je beschikking hebt. Resultaten van PCR kan je niet echt kwantificeren, hooguit een beetje. En een bandje dat volledig verdwijnt is teken van enorme DNA schade (of een fout in je PCR). Maar ben je op zoek naar het verschil tussen enorme schade en geen schade of juist naar een beetje schade?

Waarom gebruik je de data van je qRT PCR niet? De grafiek die je ons nog niet hebt laten zien kan heel interessant zijn in dit geval, om de monsters onderling te vergelijken. Je kan helaas geen absolute getallen geven omdat je geen ijklijntje hebt meegenomen in je run.

qRT PCR producten mogen dan wel SYBR-green bevatten, maar onder welke golflengte zie je dat terug? En hoe sterk?

Zoek het even uit, maar ik verzeker je er alvast van dat je gewoon EtBr en loading dye moet toevoegen om de boel zichtbaar te maken op gel.

Om de kans dat je resultaten hebt te vergroten zou ik proberen een PCR-apparaat met temperatuur gradient te gebruiken (verschillende Ta). Als je dan een graad onder en boven de theoretische Ta van je primers gaat zitten, heb je een vrij grote kans dat de boel werkt. Vergeet niet dat je vrij standaard primers gebruikt dus zoek na wat anderen gedaan hebben met deze primers. Bijvoorbeeld hier.

Tipje voor de PCR (of eigenlijk voor alles dat je in het lab doet): neem een positieve en een negatieve controle mee en als je een mastermix maakt, streep alles af wat je er in hebt gedaan. [strike]Water[/strike], 10x buffer, primers, de hele bende.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Smeltcurve data-analyse

Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse

Re: Smeltcurve data-analyse