Springen naar inhoud

Plasmide


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Jenske

    Jenske


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 23 juli 2009 - 13:30

hallo iedereen,

ik had een kleine vraag over een plasmide.
Ik heb oppervlakkig geleerd dat een plasmide gebruikt kan worden om vreemd DNA in een bacteriecel te krijgen.
Maar hoe werkt dit dan?

Je steekt een stuk DNA in de plasmide en dan steek je deze plasmide in de bacteriecel, maar hoe zorg je ervoor dat die bacteriecel het dna van de plasmide in haar eigen chromosoom gaat steken? (of is dit niet nodig en is het hebben van die vreemde plasmide al genoeg om dat dna zelf na te maken? Dus dat die plasmide naast het chromosoom van die bacteriecel blijft leven?

Een andere vraag die ik me stel: om het vreemde stuk dna in die plasmide te steken moet je de plasmide "openknippen" met een restrictieenzym, maar hoe weet je nu dat het vreemde dna in die "opening" van die plasmide past? of heb je voor het kapot maken van dat specifiek stuk dna hetzelfde restricie-enzym gebruikt?
(wat me trouwens nogal raar lijkt, aangezien je dan altijd op dezelfde plaatsen het dna gaat kapot snijden dat je wil overbrengen, terwijl je op voorhand niet weet welk stuk nu juist het goede is dat je wil hebben in je plasmide)

groeten

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8251 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 juli 2009 - 14:00

Plasmides worden middels electroporatie, calcium of een hitte schok in een bacterie cell getransformeerd. Om er voor te zorgen dat de bacterie dit DNA niet weer uit de cel gooit zal er meestal een antibiotica resistentie gen in de plasmide zitten en zal de bacterie groeien in medium waar antibiotica in zit. Het plasmide zal niet in het chromosoom komen maar als extrachromosomaal DNA in de bacterie blijven.

Restrictie enzymen kunnen op sequentie specifieke plekken in DNA (in dit geval de plasmide) knippen. Vervolgens zal het insert, wat uit een PCR product of een andere cultuur komt ook worden geknipt en op gel worden gescheiden en geisoleerd. Door geknipt plasmide en insert in de juiste verhouding bij elkaar te brengen in aanwezigheid van ligase en een juiste buffer zal er een samensmelting van insert en plasmide plaatsvinden.

Dit zal uiteindelijk in een bacterie cultuur worden getransformeerd en uitgeplaat op een bacterieplaat, de kolonies die je aantreft worden vervolgens in vloeibaar medium verder opgegroeid en kunnen dan doormiddel van sequencing of digestie worden geanalyseerd op de aanwezigheid en orientatie van je insert.
"Meep meep meep." Beaker

#3

Dalton

    Dalton


  • >250 berichten
  • 808 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 juli 2009 - 14:10

Het plasmide blijft intact in de bacterie.
Dit is normaal voor bacteriŽn (en heel handig voor onderzoek).
De bacterie gebruikt de plasmide alsof het zijn eigen genoom is maar het wordt niet stuk geknipt en ergens aangeplakt ofzo. Het plasmide blijft gewoon bestaan.

DNA kan je alleen aan elkaar plakken met behulp van zogenaamde "sticky ends".
De meeste restrictie enzymen knippen niet recht door het DNA zodat je een paar nucleotiden enkelstrengs DNA hebt.
Hoe dat stukje enkelstrengs DNA eruit ziet verschilt per restrictie enzym.
Als je jouw DNA op dezelfde manier geknipt hebt (dus met hetzelfde enzym) dan heeft jouw DNA precies dezelfde "sticky end". Als je vervolg dat DNA weer gaat repareren (ligeren) dan past jouw DNA precies op het plekje dat je geknipt hebt in de plasmide.
Van te voren weet je precies de sequentie van je plasmide en DNA, en aangezien het tientallen of honderden verschillende restrictie enzymen zijn is er altijd wel eentje die je plasmide maar 1x knipt zodat je precies weet waar.

Vaak worden trouwens twee restrictie enzymen gebruikt, 1 voor elke kant van jouw DNA. Het plasmide moet dan ook met die twee enzymen geknipt worden zodat jouw DNA als een puzzelstukje er precies in past.

Edit: Wouter was me voor en blijkbaar heb ik 10 minuten nodig om een reply te schrijven ;)
Maar het is toch een aanvulling.

Veranderd door Dalton, 23 juli 2009 - 14:12

Minder dan niks is onmogelijk.
De enige uitzondering op deze regel is mijn salaris.

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8251 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 juli 2009 - 14:12

Niet alleen sticky-end maar ook blunt-end (zonder enkelstrengs overhang) kan er worden geknipt door restrictie enzymen en dit word soms ook gebruikt hoewel het lang niet zo fijn werkt.
"Meep meep meep." Beaker

#5

Dalton

    Dalton


  • >250 berichten
  • 808 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 juli 2009 - 14:13

Klopt je hebt gelijk.
Maar zoals je al aangeeft wordt dat minder vaak gebruikt.
Minder dan niks is onmogelijk.
De enige uitzondering op deze regel is mijn salaris.

#6

Jenske

    Jenske


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 23 juli 2009 - 14:17

Ok bedankt voor je antwoord.

Ik heb echter nog 1 vraag. Je zegt:

Het plasmide zal niet in het chromosoom komen maar als extrachromosomaal DNA in de bacterie blijven.


Ik vraag me dan echter af als die plasmide niet in het chromosoom wordt opgenomen, hoe kan je dan een bacterie variant vormen die een bepaald gen mist.

Ik vraag dit omdat men plasmides gebruikt om bacterien te muteren naar een variant waar een bepaald gen nietmeer inzit.

Ik heb gelezen dat men hiervoor plasmides gebruikt, maar als deze plasmides niet ingebouwd worden in het chromosoom van de bacterie waar je het gen uit wilt verwijderen, hoe kan je dan dit gen uit die bacterie halen?

Je moet toch het chromosoom van die bacterie zelf gaan veranderen?

#7

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8251 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 juli 2009 - 19:16

Dan moet je eens dit wiki artikel doorlezen.
"Meep meep meep." Beaker

#8

spark

    spark


  • 0 - 25 berichten
  • 25 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 12 september 2009 - 13:05

Ik heb hier ook een vraag over. Stel je knipt lambda-DNA met HindIII, hieruit ontstaan dus verschillende DNA fragmenten. Is het nou zo dat als je bijvoorbeeld het plasmide pUC18 ook knipt met hindIII, dat alle fragmenten (behalve de eerste en laatste van de streng, die hebben tenslotte maar 1 sticky end) dan geligeerd kunnen worden met pUC18?

#9

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8251 berichten
  • VIP

Geplaatst op 12 september 2009 - 15:20

Ik zou niet inzien waarom dit niet zou werken. Let hierbij wel op de juiste verhoudingen en een alkalische phosphatase behandeling van je plasmide nadat je deze hebt gedigesteerd, anders is de kans op vals positieve kolonies veel te groot.

*ik ga hier voor het gemak van uit dat in pUC18 slechts 1 keer word geknipt door HindIII en dan niet in de antibiotica resistentie.
"Meep meep meep." Beaker

#10

spark

    spark


  • 0 - 25 berichten
  • 25 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 12 september 2009 - 16:29

Ik zou niet inzien waarom dit niet zou werken. Let hierbij wel op de juiste verhoudingen en een alkalische phosphatase behandeling van je plasmide nadat je deze hebt gedigesteerd, anders is de kans op vals positieve kolonies veel te groot.

*ik ga hier voor het gemak van uit dat in pUC18 slechts 1 keer word geknipt door HindIII en dan niet in de antibiotica resistentie.


Wouter, bedankt voor je antwoord!. Om vals positieve kolonies tegen te gaan worden ampicilline-platen gebruikt, dit gen blijft ongerept. De ligatie vindt plaats op de MCS in het lacZ gen, er wordt dan ook een blauw-wit screening gedaan om na te gaan of de transformatie is gelukt.

#11

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8251 berichten
  • VIP

Geplaatst op 12 september 2009 - 17:22

Dat zou zeker moeten werken. De belangrijkste stappen (naar mijn mening) zijn een goede alkalische phosphatase behandeling (uit m'n hoofd een kwartier) en een juiste verhouding van je gezuiverde vector en insert. Ik zou je aan willen raden (maar waarschijnlijk zal dat al wel in de cursus staan) om verschillende molaire verhoudingen te proberen, bijvoorbeeld 3:1, 1:1 en 1:3.
"Meep meep meep." Beaker





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures