Rflp en southern blot

Lauraa00

Hallo allemaal!

Ik probeer al een tijdje uit te vogelen hoe dat nou zit met die Restriction fragment length polymorfisms. Ik heb er hele duidelijke colleges over gehad, maar toch begrijp ik het nog niet. Ik snap niet wat het verschil is tussen de southern blot, en RFLP-analyse.

De southern blot is in mijn ogen een methode waarbij je dna in stukjes knipt en kijkt hoe lang de stukjes zijn: als daar verschillen tussen zijn dan heb je misschien wel een mutatie.

RFLP-analyse is naar m'n idee precies hetzelfde. Een restrictie enzym knipt DNA in stukken en met een of ander radiologische probe kan je de stukken herkennen, die variëren binnen de populatie. Wanneer gebruik je nou welke methode? Ik weet dat je ook southern blot gebruikt voor de determinatie van RFLP, wat het voor mij niet duidelijker maakt. Wie o wie kan me het duidelijk uitleggen?

Groetjes,

Laura

Wouter_Masselink

Voor een RFLP hoef je niet perse een Southern blot (uitgevonden door de beste meneer Southern dus met een hoofdletter 'S') uit te voeren.

Het klopt dat in beide gevallen een digestie plaats vindt en dat deze vervolgens op agarose gel kan worden gezet. In een RFLP kan je dan deze fragmenten detecteren door middel van EtBr. Voor een Southern blot moet er eerst een blot van je agarose gel worden gemaakt op een blad cellulose en dan kan dit geblotte materiaal vervolgens geprobed worden met specifieke DNA probes. Hierdoor krijg je een sequentie specifieke detectie van in stukken geknipt DNA terwijl een RFLP on-specifiek DNA detecteerd.

Themisto

Southern blotting is een veelgebruikte techniek die je kan gebruiken om een specifieke sequentie in geknipt DNA te kunnen vinden, m.b.v. specifieke probes die hybridiseren aan het DNA na blotting op een membraan.

Echter, RFLP is een methode om bepaalde mutaties/polymorfisme aan te kunnen tonen... en dat kan zichtbaar gemaakt worden op verscheidene manieren. Ik voer bijv. een PCR-RFLP uit. Hierbij amplificeer ik een bepaald gedeelte van een gen, waarvan ik het amplicon vervolgens knip met van te voren gekozen restrictie-enzymen. Je weet o.b.v. de sequentie van het amplicon al of een restrictie-enzym wel/niet knipt en waar deze knippen, en dus kan je ook voorspellen wat de verschillende groottes van de DNA fragmenten zullen zijn na digestie. Het principe van de PCR-RFLP berust op de specifieke sequenties die de restrictie-enzymen herkennen. Je kan je voorstellen dat bij het wijzigen van één basepaar binnen een restrictie-site, tot gevolg kan hebben dat de restrictie-site verdwijnt. Op die manier kunnen er door mutaties/polymorfismen ook weer restrictie-sites verschijnen binnen het amplicon. Dit analyseer ik op een gewone agarose gel en dan vergelijk ik het 'fragmenten patroon' met de verwachtingen.

Een Southern Blot bij een RFLP kan in principe de PCR stap vervangen als het ware. Je knipt je genomische DNA/cDNA(als je alleen wilt analyseren binnen exonen) met het gewenste restrictie-enzym en m.b.v. je probe gericht op het specifieke fragment(en) dat je wilt analyseren controleer je of de grootte van dat fragment naar verwachtting is.

Ik hoop dat ik je hiermee voldoende heb kunnen informeren.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Rflp en southern blot

Rflp en southern blot

Re: Rflp en southern blot

Re: Rflp en southern blot