Springen naar inhoud

Restrictiesites toevoegen dmv pcr


  • Log in om te kunnen reageren

#1

666macho

    666macho


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 27 mei 2010 - 12:29

Hoi,

Ik had een vraag over PCR voor het gebruik in klonering.
Voor de klonering wordt heel simpel gezegd, een gen met pcr vermenigvuldigd, tijdens de PCR wordt aan het einde van het PCR product restrictie sites gezet (die er voorheen niet oorspronkelijk in het gen zaten!) zodat daar vervolgens geknipt kan worden om het in een DNA plasmide te zetten voor expressie in bacterie/cellijn.

Mijn vraag gaat over hoe die restrictie sites plotseling aan het uiteinde van het PCR product komen.
Dit wordt gedaan door de primers iets te verlengen en daar dan de restrictiesequentie in te zetten.
Maar ik kan me niet goed een beeld vormen van hoe vervolgens de dit dan vervolgens alsnog in het PCR product komt.

Kan iemand dit misschien voor mij uitleggen?
Alvast hartstikke bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 27 mei 2010 - 12:44

De restrictie site zit inderdaad gewoon aan je primer, daar houd je rekening mee als je het ding ontwerpt. De primer is aan het 5' einde een paar basen langer dan je normaal nodig hebt. Je krijgt dan een spacer, restriction site en de primer sequence.
Je zorgt er gewoon voor dat het (blunt of sticky) eindje dat je na het knippen over hebt aan je PCR product, compatible is met het einde dat je over hebt na het openknippen van je plasmide. Ligeren en klaar, zo simpel is het ;)
Goed, dat deel lijk je te begrijpen maar dan..
Je vraagt

Maar ik kan me niet goed een beeld vormen van hoe vervolgens de dit dan vervolgens alsnog in het PCR product komt.

Je snapt niet hoe een langere primer werkt in PCR? Net als elke andere primer. Waarom zou de PCR er rekening mee houden wat het doel is van je verlengde primer? Een primer is een primer..
Of vraag je je af of die primer wel zal hechten aan je template? Nou.. grotendeels ;) Het stukje dat niet zal hybridiseren met de template wordt in de volgende reacties wel weer meegenomen want dan is het zelf enkelstrengs template en maakt het niet meer uit.

Is dat wat je bedoelde?
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#3

666macho

    666macho


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 28 mei 2010 - 15:37

Oke, dus als ik het goed begrijp hecht de primer voor de helft ( je restrictie gedeelte niet) aan het DNA.
De DNA polymerase hecht vervolgens aan het 5' van je primer, en begint vanaf daar nucleotiden toe te voegen?
Eerst nucleotiden aan het primer gedeelte wat niet vast zit aan de DNA template (restrictiesite van je primer), en vervolgens loopt de polymerase dan verder
(Korte visualisatie zoals ik het denk zie bijlage)
klopt dit? Want dan snap ik het wel

Bijgevoegde afbeeldingen

  • untitled.JPG

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 28 mei 2010 - 15:42

Het principe klopt inderdaad, echter je 5'-3' staat verkeerd om. Verder zal je aan je overhang ook nog een linker region toe moeten voegen (meestal ATAT of CGCG afhankelijk van je Tm) om er voor te zorgen dat je restrictie enzymen werken, ze knippen niet goed helemaal op het uiteinde van het DNA.

Verder wil ik je er nog aan helpen herinneren dat je er op moet letten dat je gen van interesse in-frame staat.
"Meep meep meep." Beaker

#5

666macho

    666macho


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 mei 2010 - 10:00

De linker had ik idd niet in de illustratie gezet, en ik zie dat de 5'-3' ook verkeerd stonden.
Maar het principe snap ik nu, harstikke bedankt!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures