Springen naar inhoud

Recombinant dna nadelige effecten?


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Skyliner

    Skyliner


  • >100 berichten
  • 247 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2011 - 12:50

Als men adhv restrictie-enzymen en ligasen een bepaald gen wil implementeren in plasmide DNA (om het te kloneren), zal dat gen er dan niet voor zorgen dat de leefbaarheid/generatietijd/... daardoor beÔnvloed wordt?

Want ik kan mij inbeelden dat als een vreemd gen wordt ingebouwd in een DNA streng, dat toch op de ťťn of andere manier een nadelig effect (of voordelig) heeft op de nakomelingen?

Bvb het gen dat men wil kloneren kan voor de expressie van het gewilde eiwit zorgen, maar dit inhibeert bvb de celwandsynthese van de bacterien waar het gen in de eerste plaats werd ingebouwd, waardoor de cultuur meteen onleefbaar wordt.

Of heeft men allerhande technieken ontwikkeld hiervoor om zulke dingen te omzeilen (bvb. inhibitors in de translatie ervan)? of is het vaak gewoon zo dat de beoogde genen zo specifiek zijn dat ze geen invloed hebben op de fysiologie/metabolisme/... van de bacterie?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Xenion

    Xenion


  • >1k berichten
  • 2606 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 25 mei 2011 - 13:41

Mijn kennis van biotechnologie is vrij beperkt, maar uit wat ik uit mijn lessen heb begrepen worden er gewoon enorm veel experimenten gevoerd.

Men weet niet op voorhand welk effect een bepaald gen zal introduceren. Het wordt gewoon gedaan en dan wordt er gekeken wat er gebeurt in het organisme. Of die muis of die bacterie dood gaat of niet, dat maakt toch niet uit en op die manier kan er gekeken worden naar de effecten van verschillende genen of combinaties ervan.

#3

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 mei 2011 - 15:40

Afhankelijk van het gen wat men inbrengt zijn er ruwweg 3 dingen die verkeerd kunnen gaan. De fysieke incorporatie van een gen in een genoom kan precies op de plek waar net een ander cruciaal gen zit gebeuren (niet van toepassing bij bacterien aangezien je hier doorgaans met extrachromosomaal DNA te maken hebt). Een andere mogelijkheid is de extra energie die het kost puur en alleen om dit specifieke gen af te lezen. Dit is slechts in theorie een miniem verschil, zeker wanneer men gebruik maakt van antibiotica resistentie genen op het plasmide wat men inbrengt dan zal men dit gen zeker niet gaan verliezen aangezien het selectievoordeel voor dit gen veel te groot is. Als laatste is het inderdaad mogelijk dat een gekloond gen een specifiek nadelig effect zal hebben. Zolang de cell hierdoor niet direct dood gaat en celldelingen ook gewoon plaats kunnen vinden zal de bacterie cultuur gewoon blijven leven (mede door de selectie druk van de antibiotica resistentie). Van de meeste genen is redelijk accuraat te voorspellen wat zijn biologische functie is en wat de potentiele effecten zijn.
"Meep meep meep." Beaker

#4

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 26 mei 2011 - 11:09

(om het te kloneren)

Zou je dat woord nooit meer willen gebruiken aub? ;)
Het is ooit in het vak terecht gekomen maar het is eigenlijk een verkeerd woord. Het is gewoon klonen.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#5

Skyliner

    Skyliner


  • >100 berichten
  • 247 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 mei 2011 - 07:57

Ik zal er op letten in het vervolg als ik nog eens 'kloneren' zeg! ;)

Bedankt alleszins voor de antwoorden!

#6

Skyliner

    Skyliner


  • >100 berichten
  • 247 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 juni 2011 - 11:16

Ik heb nog wat interessante antwoorden gevonden, voor als jullie het ook wilden weten. PCR wordt het grootste deel van de tijd gebruikt om dus bepaalde genen van eiwitten (zoals insuline, interferons) te amplificeren. In de farmaceutische sector is vaak enkel de amplificatie van eukaryotische genen en eiwitten relevant. Dus eiwitten die eigenlijk niet voorkomen in prokaryoten zoals E.coli.

In de overgrote meerderheid van de gevallen wordt het vreemd DNA simpelweg passief door de plasmidevector gerepliceerd en wordt het niet door de gastheer als een functionele genetische informatie-eenheid herkend.

Een eukaryotische promotor zal bijvoorbeeld niet herkend worden door een prokaryotische transcriptiemachinerie en vice versa. Hetzelfde geldt ook voor de RBS (ribosome binding site); eukaryoten hťbben zelfs geen RBS in hun mRNA (omdat de zgn. kozaksequentie en de capstructuur volstaat als efficiente binding van ribosomen). En voor zover ik weet gebeurt er ook geen 'splicing' bij Prokaryoten. Dus in feite zal een gekloneerd eukaryotisch gen, zelfs indien voorzien van alle benodigde controlesignalen, in een prokaryoot geen aanleiding geven tot een correct vertaalbaar transcript omdat de introns door de bacterie niet uit de primaire boodschap verwijderd kunnen worden.

Natuurlijk is dat op het eerste zicht paradoxaal, want vandaag kan men toch efficiŽnt eiwitten aftappen van bacteriŽn. Men heeft dan ook een techniek gevonden om zgn. 'expressievectoren' in te bouwen, die voorzien zijn van de nodige controlesignalen om een efficiŽnte transcriptie en translatie van een ingebouwd heteroloog gen te verzekeren (ook krachtige promotor, en sterke RBS).

Maar dan nog blijven bacteriŽn als het ware 'passief' alles vertalen naar eiwitten. Dat is wel een geluk eigenlijk he? Want voor hetzelfde geld faalt het volledig celmetabolisme van die bacterie. Ik heb wel gelezen dat men inderdaad moet oppassen, want als er teveel eiwitten geproduceerd worden in de cellen, slagen deze neer, en zijn ze slechts heel moeilijk recupereerbaar.

;)

#7

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 juni 2011 - 11:48

PCR wordt het grootste deel van de tijd gebruikt om dus bepaalde genen van eiwitten (zoals insuline, interferons) te amplificeren.

Da's niet helemaal waar want hoe lang zijn dit soort genen en hoe lang is het langste fragment dat je betrouwbaar kan amplificeren?
De precieze toepassing ligt verder helemaal aan het veld waarin je werkt. In (moleculaire) microbiologie is PCR een belangrijke diagnostische tool bijvoorbeeld. In forensisch onderzoek heeft het weer een heel andere toepassing en in de moleculaire biologie zal vaak gewerkt worden met cellijnen waar je een gen in zet dat ze normaal niet hebben, bijvoorbeeld voor een receptor. Zonder PCR is het zo goed als onmogelijk om de vector (plasmide) te maken.

Ik heb wel gelezen dat men inderdaad moet oppassen, want als er teveel eiwitten geproduceerd worden in de cellen, slagen deze neer, en zijn ze slechts heel moeilijk recupereerbaar.

Klopt: als de eiwitproductie te hoog is, gaat het ten koste van de productie van andere eiwitten die de cel nodig heeft om in leven te blijven. Het is dan 'gewoon' competitie om de machinerie. Ook kan een ophoping van eiwit in de cel allerlei processen verstoren en in sommige gevallen tot apoptose leiden.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#8

Skyliner

    Skyliner


  • >100 berichten
  • 247 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 juni 2011 - 12:38

Da's niet helemaal waar want hoe lang zijn dit soort genen en hoe lang is het langste fragment dat je betrouwbaar kan amplificeren?



Bedoel je dat sommige genen gewoonweg te lang zijn om volledig te amplificeren? Dat klinkt inderdaad wel logisch, aangezien eiwitten soms bestaan uit verschillende subunits in allerlei vouwstructuren. Was de maximale lengte niet afleidbaar van het maximaal aantal cycli die een PCR kan doorlopen? Ik dacht maximaal 30 vooraleer de betrouwbaarheid van u PCR begon af te nemen, kan dat?

#9

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 juni 2011 - 22:03

Nu haal je twee dingen door elkaar. De lengte van- en het aantal fragmenten.
Hoe lang is een beetje stevig gen? Tot hoe lang is een 'normaal' PCR fragment ongeveer? Hint: wat is het bereik van veelgebruikte ladder markers bij elektroforese op een agarose gel ongeveer?
Waarom zou een PCR onbetrouwbaar worden na meer cycli?
En: zou de duratie van de elongatie iets te maken hebben met de lengte van je fragment?

Veranderd door Mrtn, 05 juni 2011 - 22:04

Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#10

Xenion

    Xenion


  • >1k berichten
  • 2606 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 17 juni 2011 - 12:14

Hoe lang is een beetje stevig gen? Tot hoe lang is een 'normaal' PCR fragment ongeveer? Hint: wat is het bereik van veelgebruikte ladder markers bij elektroforese op een agarose gel ongeveer?
Waarom zou een PCR onbetrouwbaar worden na meer cycli?
En: zou de duratie van de elongatie iets te maken hebben met de lengte van je fragment?


Zou je deze vragen eens zelf kunnen beantwoorden aub? Ik ben dit momenteel aan het studeren, maar mijn cursus vermeldt dit niet :/

#11

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 17 juni 2011 - 14:38

Mrtn stelde deze vragen niet omdat hij dit zelf niet zou weten, dit was slechts een poging om Skyliner hier zelf logisch over na te laten denken. We zijn inmiddels redelijk ver van de oorspronkelijke vraag afgedwaald, ik zou iedereen dan ook willen vragen om bij volgende vragen die niet direct aansluiten bij de OP een nieuw topic te openen.
"Meep meep meep." Beaker

#12

Xenion

    Xenion


  • >1k berichten
  • 2606 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 17 juni 2011 - 16:22

Mrtn stelde deze vragen niet omdat hij dit zelf niet zou weten, dit was slechts een poging om Skyliner hier zelf logisch over na te laten denken.


Ik ben me hier wel van bewust, maar dit topic is inmiddels al een week oud en en zou gewoon graag de antwoorden op die vragen weten ;)





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures