Springen naar inhoud

Detectielimiet gelelectroforese


  • Log in om te kunnen reageren

#1

butterfly77

    butterfly77


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 31 juli 2011 - 15:07

Hoi!

Ik heb een vraag; Voor een project ben ik bezig met het isoleren van DNA uit de haarwortel. De isolatie is gedaan met behulp van de investigator kit van Qiagen (Hair protocol)
Nu zie ik geen resultaat als ik een 1% agarose gel maak en vroeg ik mij af of ik dat wel kon verwachten. De nanodrop en Quant-it geven namelijk concentraties niet hoger dan 0,5ng/ul.
Is dit wel aan te tonen met een 1% gel?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 01 augustus 2011 - 14:46

Als er op een nanodrop 0.5 ng/uL als concentratie gegeven is dan zal je isolatie waarschijnlijk niet goed zijn verlopen. Tevens, aangezien je hier te maken hebt met chromosomaal DNA zal dit zowiezo niet resulteren in een scherpe band op je gel, onafhankelijk van je concentratie. Als we er dan toch van uit gaan dat je te maken hebt met een scherpe band dan is je detectie limiet ~ 10 ng en zal je dus minimaal 20 uL op moeten brengen. Tevens ben ik er in deze benadering vanuit gegaan dat je 0,5 ng/uL een daadwerkelijke concentratie is en niet gewoon wat ruis. Een nanodrop kan heel makkelijk werken en je snel een resultaat geven, echter de getallen achter de komma bij een nannodrop zou ik met een korrel zout nemen. Ik zou jou gemeten concentratie dan ook als 0 ng/uL schrijven en er van uitgaan dat je isolatie is mislukt

Waarom zou je deze isolatie uberhaupt op gel willen zetten?

Als je dit toch allemaal om wat voor reden dan ook op gel zou willen zetten dan zou je een alternatieve methode kunnen gebruiken. Door je samples te runnen op een polyacrylamide gel gevolgd door een zilver staining. Dit heeft een veel lagere detectie limiet.

Vertel eens wat je uiteindelijke doel is, misschien kunnen we je hier met een andere methode of wat tips op weg helpen.
"Meep meep meep." Beaker

#3

butterfly77

    butterfly77


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 02 augustus 2011 - 18:28

Bedankt voor je reactie.

Ik heb er zelf ook aan gedacht of de isolatie misschien niet gelukt was, meerdere keren gaf de nanodrop geen resultaat. 1 keer ben ik er toch mee doorgegaan en na PCR was er op gel wel wat zichbaar.
Ook zou ik geen andere isolatie methode weten. Aan deze methode had ik de incubatie tijd al verlengt en 20 haarwortels toegevoegd.
Op gel zetten is eigenlijk standaard op mijn studie, om te controleren of je uberhaupt DNA hebt geisoleerd. Dat is meer de reden. Wat (qua grootte (bp)) en hoeveel ik kon verwachten wist ik niet.

Het doel van het onderzoek is nagaan of bepaalde omstandigheden (temperatuur, soort water & incubatie tijd (temperatuur + water) van invloed zijn op het DNA (en de degradatie dus)

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 03 augustus 2011 - 02:36

Op gel zetten is prima, het gaat er om dat je te maken hebt met chromosomaal DNA en dit dus zowiezo geen duidelijke bandjes zal geven op gel (zonder PCR).
"Meep meep meep." Beaker

#5

butterfly77

    butterfly77


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 15 augustus 2011 - 15:53

Waarom is dat niet aan te tonen op een gel dan? Is er een bepaalde grootte of hoeveelheid voor nodig?
En hoe zou ik na de isolatie na kunnen gaan wat de concentratie is? Met de Nanodrop en Quant-it tot nu toe geen resultaten, maar ik kan niet goed verklaren waarom (zeker niet met de Quant-it)

#6

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 15 augustus 2011 - 16:23

Het komt op een gel niet uit de verf omdat humane chromosomen veel te grote, niet-lineaire stukken DNA zijn. Dat trek je dus niet lekker door een gel heen, net als een (intact) plasmide bijvoorbeeld.
Omdat het zo groot is komt het ook niet ver in je gel (binnen afzienbare tijd), zeker als je 1% agarose gebruikt. Als je de gel dan langer laat lopen trek je de ethidium bromide uit de gel en zie je geen DNA meer. Alternatief: de gel daarna in EtBr weken, wat er weer toe zal leiden dat het DNA tijdens het weken deels weg diffundeert.

Met een PCR krijg je een veel kleiner product dan de lengte van een heel chromosoom, dat kan natuurlijk wel gewoon op gel. Als je de mogelijkheid hebt zou ik een PCR proberen. Liever nog meer wortels gebruiken om de opbrengst te verhogen.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#7

butterfly77

    butterfly77


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 17 augustus 2011 - 17:36

Maar dat probleem is er toch niet bij een wangslijmvlies isolatie? Nooit gehad in ieder geval dat ik dan geen bandje zag.

Je alternatief is helaas geen optie bij mijn studie.
PCR heb ik 2 keer ingezet, waarvan ik de 1e keer wel resultaten had en de 2e keer niet. Heel raar want alles was hetzelfde uitgevoerd. Weet niet of je dat kan verklaren?
En misschien dat je kan verklaren waarom ik niks zie bij de quant-it resultaten?
tot nu toe zijn 20 haren gebruikt met wortel. Zou je adviseren dat dat er nog meer zouden zijn? of?

#8

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 17 augustus 2011 - 22:34

Volgens mij mag je met een stuk of wat haarwortels rekenen op enkele nanogrammen (enkele tientallen?) waar je bij een buccal swab 100-300ng verwacht.

Wat betreft je PCR: deed je positieve controle het wel? Ben je misschien iets vergeten toe te voegen aan de master mix? Zijn de primers vergaan omdat ze per ongeluk naast de UV-bak stonden? ;)
Wat zag je de vorige keer op je gel, toen je toch met je sample was doorgegaan? Weet je zeker dat het fragment dat je op gel terug zag even groot was als je verwachtte? ..niet een verontreiniging of primer dimeren?

Veranderd door Mrtn, 17 augustus 2011 - 22:37

Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#9

butterfly77

    butterfly77


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 18 augustus 2011 - 17:21

Maar met die buccal swab waarom heb je dan geen problemen dat het groot en niet lineair is?
2 primersets gebruikt (amelogenine 106 bp en 977 bp) bij 1 isolatie deden ze het allebei. Dat was DNA uit haarwortel isolatie zonder enige omstandigheden. Daarna nogmaals een isolatie waarbij ze een dag in water hadden gelegen.
hierbij was wel resultaat bij 106 bp en de positieve. de positieve en 977bp primersets gaven geen resultaat.
Lijkt me dus niet te liggen aan de primers ;) of iets vergeten te toe voegen :P
De fragmenten waren van de grootte die ik verwachtte ja.
Dus waarom bij die 2e isolatie de grotere primerset geen amplicon gaf en de positieve het niet deed??

#10

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 19 augustus 2011 - 03:47

Bij een buccal swab heb je dat probleem nog steeds. Echter doordat de opbrengst veel groter kan zijn zal je waarschijnlijk nog wel iets op je gel zien (een smeer), maar zeker geen mooi strak bandje.

Waarom je positieve controle het niet deed, geen idee. Kwestie van iets verkeerd gedaan, dat is in ieder geval duidelijk.
"Meep meep meep." Beaker

#11

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 februari 2012 - 22:17

Hoeveel ng DNA gebruikt je per PCR reactie? (Hoe is je reactiemix samengesteld?)

Waarom is een alternatief voor de controle van je DNA preparaat niet mogelijk op je studie?


Als ik zelf een DNA preparaat controleer dan doe ik dat gewoon op een nanodrop. Als je namelijk genomisch (hoog moleculair) DNA opbrengt op een agarose gel, zal dat doorgaans niet goed door de gel heen lopen. Wat je vaak ziet is dat het DNA in het slotje van je gel blijft zitten of er heel vlak bij. Om het alsnog zichtbaar te kunnen maken zou je een fractie van je DNA preparaat kunnen knippen met een veelgebruikt restrictie-enzym. Dit zou als het ware een 'waas/veeg' over de gehele laan kunnen opleveren. Overigens is een geslaagde PCR ook een goede controle op je DNA. Er word wel eens een zogenaamde ladder PCR uitgevoerd om DNA preparaten te controleren.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures