Springen naar inhoud

eiwitten aantonen


  • Log in om te kunnen reageren

#1

blondie_vandorsten

    blondie_vandorsten


  • 0 - 25 berichten
  • 7 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 13:29

Hallo,
Ik vroeg mij af hoe ik moet aantonen, als ik een bepaald voedingsmiddel heb, hoeveel eiwitten er in zitten.
Met welke apparaten en stoffen kan ik dit meten?
Alvast bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 17:25

eiwitten zijn te meten door deze op te lossen in water en daarna de extincite te bepalen. Hiervoor is het belangrijk om er voor te zorgen dat de eiwitten oplossen.

Hieronder vind je een SOP om het gehalte oplosbare eiwitten te bepalen.
===============================================
De biureet reactie is een methode die kan worden gebruikt om de hoeveelheid oplosbare eiwitten in een oplossing te bepalen. Het biureet reagens (kopersulfaan in een sterke base) reageert met peptide bindingen en veranderd dan van kleur. De spectrofotometer kan dan worden gebruikt om de extinctie te bepalen. Des te meer eiwitten aanwezig, des te donkerder zal de kleur zijn.

benodigde materialen:
1. NaOH 1M oplossing
2. Biureet reagens
3. Micro titer platen 8X12 (greiner)
4. Reader (Organon teknika of biorad)
5. aanpasbare multichannel pipet
6. Mix aparaat om het reagens in de microtiter platen te mixen.
7. 0,9 m/m % NaCl oplossing
8. BSA standaard oplossing: 10 mg/ml BSA (Bovinde Serum Albumine) in 0,9 m/m % NaCl (opslaan in de vriezer)


Procedure:
Gebruik de BSA standaard oplossing om een calibratie concentratie serie te maken. deze moeten respectievelijk 0 (blanco), 2, 4, 5, 8 en 10 mg BSA/ml bevatten. Voer het verdunnen uit met 0,9 m/m % NaCl oplossing en gebruik volumetrisch glaswerk.

Pippeteer in 5-voud 80 mu.gif L van de callibratie concentratie serie en ook van de monsteroplossing in de putjes van de micro titer platen. Pipeteer hierbij 120 mu.gif L biureet reagens. Mix de oplossingen direct met behulp van het mix apparaat (vermeld onder 6). Incubeer de oplossingen 30 minuten lang op kamer temperatuur. Bepaal de concentratie met behulp van de reader (vermeld onder 4).

Data:
Bepaal de hoeveelheid eiwit in je monster.
Maak een callibratie curve van de gemiddelde extinctie en de concentratie van het eiwit in de standaard oplossingen met behulp van excel. Gebruik 'Error analysis' (Data analyse) om beta.gif , alfa.gif , S alfa.gif en S beta.gif . Bepaal tevens X0 en Sx0 en geef een conclusie van je resultaten.
===============================================

De golflengte van licht dat wordt gebruikt moet 280 nm zijn.


Deze methode maakt gebruik van microtiter platen. Deze is ook aan te passen tot een andere methode waarbij je in plaats van micro titer platen reageerbuizen gebruikt en in plaats van een reader gebruik je dan gewoon een fotospectrometer.

Belangrijk: denk er bij je monster aan dat je deze kiest op ongeveer 5 mg/ml. Zo krijg je de kleinste fout. Tevens is het belangrijk om voor de monster bepaling een eiwit te kiezen dat goed oplost. Eventueel zou je hiervoor beta.gif mecapto-ethanol kunnen gebruiken. Echter het is handiger en beter om als monster ook BSA te gebruiken.
"Meep meep meep." Beaker

#3

Onzejozef

    Onzejozef


  • >100 berichten
  • 124 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:06

Word voor eiwitanalyse niet SDS-electroforese gebruikt?

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:18

SDS kan hier ook zeker voor worden gebruikt. Hiervoor heb ik zo geen voorschrift liggen. Tevens denk ik uit de vraagstelling van de TS af te kunnen leiden dat we niet met een heel hoog niveau (niets persoonlijks :wink: ) te maken hebben.

Om onze collega's van het chemieforum maar even te quoten:

"SDS, oftwel natriumdodecylsulfaat, denatureert eiwitten en maakt deze uniform negatief zodat alle eiwitten opbasis van lading te scheiden zijn in gelelectroforese. (hiervoor wordt er ook 2mercaptoethanol toegevoegd om zwvelbruggen te reduceren.)"

Hier moet ik als 2D elektroforese expert wel even op reageren, want dit is wel een beetje snel door de bocht.
SDS bindt inderdaad aan eiwitten, en wel zodanig dat alle eiwitten netto negatief geladen zijn. SDS-eiwit complexen worden gevormd in een verhouding van ongeveer 1.4 g SDS per gram protein. De scheiding die vervolgens in SDS-PAGE plaatsvindt, kan dus niet meer op basis van lading plaatsvinden. Dat gebeurt immers in de eerste dimensie tijdens de isoelektro fokussering (IEF), waar juist absoluut geen SDS of ander geladen detergens aanwezig mag zijn. Tijdens IEF is dan ook meestal CHAPS of NP-40 als detergens aanwezig. Door aanwezigheid van SDS speelt de intrinsieke lading van het eiwit geen rol meer, en vindt de scheiding van eiwitten juist op relatieve grootte plaats. DTT of 2-mercaptoethanol wordt inderdaad nog toegevoegd om de disulfide bruggen te verbreken.


bron
"Meep meep meep." Beaker

#5

Onzejozef

    Onzejozef


  • >100 berichten
  • 124 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:20

precies, dat bedoelde ik :shock: . Zelf ben ik ook niet heel bekend met deze techniek (ik weet alleen de theorie, zelf nog nooit gedaan), maar dit leek me gewoon een eenvoudige manier.

#6

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:30

Het is een moeilijkere methode dan mijn eerste methode (naar mijn mening). Tevens lijkt het me zeker niet preciezer (tenzij je te maken hebt met onoplosbare/slechtoplosbare eiwitten).
"Meep meep meep." Beaker

#7

Onzejozef

    Onzejozef


  • >100 berichten
  • 124 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:32

Elk eiwit lost vouwt zich toch op in water (folding)? Dit zou dan toch geen probleem zijn?

#8

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 oktober 2005 - 18:34

Lang niet elk eiwit lost zich op in water. BSA is zo'n beetje het enige eiwit dat goed oplost in water.
"Meep meep meep." Beaker

#9


  • Gast

Geplaatst op 06 oktober 2005 - 17:57

Om gewoon een eiwit gehalte te bepalen kan je idd heel goed de spectrofotometer gebruiken.
Maar als je ze wilt scheidden op grootte, dan ga je voor de SDS-gel electroforese. Ook heel simpel, de gels zijn ook al kant en klaar verkrijgbaar. Zou je ze zelf moeten maken, dan werk je met nog niet gestold acrylamide = neurotoxine.

#10

sdekivit

    sdekivit


  • >250 berichten
  • 704 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 06 oktober 2005 - 20:26

je kunt een algemene eiwitmeting doen door UV-spectrometrie te gebruiken --> golflengte 280 nm

je kunt een SDS-PAGE doen en kleuren met Coomassie Blue

Je kunt een ELISA detectie doen en dan de kleuring bepalen met een spectrometer (480 nm)

je kunt de eerder beschreven biureet-methode gebruiken.

#11

pdeblij

    pdeblij


  • >25 berichten
  • 29 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 08 oktober 2005 - 22:30

Met electroforese kun je best makkelijk eiwit gehalte bepalen. Zelf vind ik dit makkelijker dan meten met een spectrofotometer.


Als je wil weten hoe je een eiwit bepaling met elektroforese uitvoert moet je het zeggen, dan zet ik hem hier op :shock:

#12


  • Gast

Geplaatst op 13 oktober 2005 - 21:28

SDS-PAGE is een methode waarbij je in een eiwit monster kan kijken hoeveel en hoe groot de eiwitten zijn.
SDS plakt aan alle eiwitten en maakt ze negatief geladen.
Als je deze negatief geladen eiwitten aan 1 kant van een polyacrylamide gel legt en je zet vervolgens spanning op de gel dan zullen alle eiwitten naar de positieve pool getrokken worden.
Een polyacrylamidegel bestaat uit een netwerk van draden, grote eiwitten ondergaan hierdoor veel meer weerstand (en lopen dus langzamer door de gel). terwijl de kleinere eiwitten makkelijker tussen de draden door kunnen. Vervolgens kun je de gel op verschillende manieren kleuren, de meest gebruikte kleuring is Coomassie.

Als je puur wilt kijken naar de totaal hoeveelheid eiwit en niet naar de soort dan zijn er een hoop mogelijk heden.
De makkelijkste is de A280 meten.
Voorwaarde is dat je een heldere oplossing eiwit hebt.
Je stuurt een lichtstraal met een golflengte van 280 nanometer (UV) door de oplossing eiwit zal dit licht absorberen, dus als je veel eiwit hebt komt er aan de andere kant weinig licht uit. Met een spectrofotometer is dit te meten. Over het algemeen betekend een A280 van 1,000 = 1mg/ml eiwit, maar dit varieert heel erg tussen verschillende eiwitten.

Een andere veelgebruikte methode is met gebruik van stofjes die een kleurreactie aangaan met eiwitten. Je gooit deze stof bij het eiwit en wacht een half uur. Als je veel eiwit hebt zal de oplossing donker kleuren. Met behulp van een BSA standaard lijn kun je dan de concentratie bepalen. Dit is vaak veel nauwkeuriger dan de A280 methode omdat het minder varieert tussen verschillende eiwitten.

#13

sdekivit

    sdekivit


  • >250 berichten
  • 704 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 oktober 2005 - 20:08

ELISA kun je de zuiverheid van je eiwit bepalen --> vergeet je ff te noemen.

#14


  • Gast

Geplaatst op 14 oktober 2005 - 21:41

Met een ELISA kijk je niet naar de zuiverheid, maar of het eiwit dat je zoekt aanwezig is, en in welke concentratie.
Een ELISA werkt met antilichamen die specifiek op een eiwit gericht zijn, met andere worden, een Elisa herkend alleen dat ene eiwit, alle onzuiverheden en andere eiwitten worden niet gemeten.

#15

sdekivit

    sdekivit


  • >250 berichten
  • 704 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 oktober 2005 - 09:03

Met een ELISA kijk je niet naar de zuiverheid, maar of het eiwit dat je zoekt aanwezig is, en in welke concentratie.
Een ELISA werkt met antilichamen die specifiek op een eiwit gericht zijn, met andere worden, een Elisa herkend alleen dat ene eiwit, alle onzuiverheden en andere eiwitten worden niet gemeten.


met ELISA kun je zeker wel naar de zuiverheid kijken ! Dat doe je als volgt:

Je doet eerst een algemene eiwitmeting A280 om de concentratie in je monsters te bepalen

Vervolgens ga je je monster verdunnen. Dit doe je zowel voor je uitgangsstof als voor de doorloop/fracties die je bijvoorbeeld verkrijgt via een kolomchromatografie.

Met een ELISA-scanner meet je de absorptie van de welletjes waarin je je monster met eiwit hebt geincubeerd met specifiek antilichaam.

Van die waarden maak je een grafiek van bijvoorbeeld het aantal microliter eiwitmonster in je verdunningsreeks tegen de absorptie. Bepaal de specifieke detectielimiet als 3 maal de gemiddelde absorptie van de blanco.

Bepaal vervolgens het aantal microgram eiwit die die absorptie van de detectielimiet veroorzaakt. Hiermee kun je de opzuiveringsgraad berekenen. De uitgangsstof heeft per definitie een zuiveringsgraad van 1.

--> bijvoorbeeld in plasma heb je 2 ug eiwit nodig om de detectielimiet te bereiken. In een bepaalde fractie is dit slecht 1 ug. Dat wil dus zeggen dat je minder eiwit nodig hebt om dezelfde detectielimiet te bereieken --> je fractie is zuiverder en wel 2x --> opzuiveringsgraad is 2.

Nu is zelfs ook mogelijk om de concentratie eiwit in je fractie te berekenen.

--> De zuiverheid kan ook berekend worden uit een SDS-PAGE :shock:





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures