Springen naar inhoud

Selectie van vectoren in ggo's


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Saul

    Saul


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 28 september 2011 - 10:35

Hallo iedereen,

Ik ben bezig met een studie Biotechnologie, nou ben ik de specialisatie Proces Engeneering gaan doen maar loop ik nu tegen een stukje Biotech. aan. Het betreft hier de alom bekende techniek van Recombinant DNA.
De princiepe ben ik nu wel eenigsinds machtig maar één bepaald onderdeel lijkt mij niet logisch. Ik wil graag weten of hoe ik het in gedachten heb juist is en zo niet, wat houdt het dan wel in.

We hebben al een stap uitgevoerd om het gewenste DNA in een vector te geligeren. De vectoren moeten geselecteerd worden (bijv. door het GFP gen mee te nemen in het gewenst stukje DNA). Om dit selectie gen tot expressie te laten komen moet de vector in een gastheer worden geplaatst (bijv. E. coli). De vectoren worden in grote aantallen in de E. coli geplaatst, en dan worden de koloniën die het GFP-eiwit aanmaken geselecteerd. Maar omdat er meerdere vectoren in 1 E. coli zitten weet je niet welke van deze vectoren nou het GFP eiwit bevatten en welke niet. Dus in princiepe worden zowel slechte als goede vectoren vermenigvuldigd in de E. coli?

Nu ik dit zo op typ snap ik nog minder van de selectie princiepes.. Hoe kan je nou selecteren als 1 gastheer meerdere vectoren opneemt?

Of kan je de vectoren afzonderlijk tot expressie laten komen?

Misschien kijk ik er wel gewoon heel dom tegen aan hoor, maar ik raak hier zo van in de war. Na de college's die ik hierover gevolgd hebt en het lezen van Bieman's (et al. DNA een blauwdruk) ben ik nog steeds in de war. Ik hoop dat jullie mij hier wat helderheid over kunnen geven.

Edit:
Het zelfde geldt voor reporter genen met een MCS er in (bijv. Lac Z). In theorie: als er dus een stuk DNA in het MCS wordt gezet wordt het Lac gen inactief waardoor er geen B-Galactosidase meer wordt gevormd. X-Gal wordt dan niet meer omgezet in blauwe stof en zo kun je dus de witte bacteriën van een x-gal plaat gebruiken..
In praktijk komen er dus 250 tot 500 vectoren in 1 bacterie, waardoor er vast wel 1 tussen zit waarbij het mis gegaan is en dus wel B-galactosidase aanmaakt...
Dat kan betekenen dat 499 vectoren wel goed zijn, maar deze zie je dan niet meer.

Veranderd door Saul, 28 september 2011 - 10:44


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 29 september 2011 - 10:34

Wat gebeurd er als je je getransformeerde cellen op een plaat zet? Waarom selecteer je een enkele kolonie?
"Meep meep meep." Beaker

#3

Saul

    Saul


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 29 september 2011 - 13:21

Wat gebeurd er als je je getransformeerde cellen op een plaat zet? Waarom selecteer je een enkele kolonie?


Laat maar, ik ben er al achter.
Per cel komt er maar 1 vector naar binnen en niet 500... Daarom kan je een kolonie selecteren die dus allemaal dezelfde vector hebben.

Ik begreep het gewoon totaal verkeert, maar iemand heeft het mij vandaag kunnen uitleggen.

Bedankt.

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 29 september 2011 - 14:34

Vergis je niet, er kunnen per cel meerdere plasmides voorkomen. Wel eens gehoord van copy-number variation?
"Meep meep meep." Beaker

#5

Saul

    Saul


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 29 september 2011 - 17:00

Vergis je niet, er kunnen per cel meerdere plasmides voorkomen. Wel eens gehoord van copy-number variation?

Hmm nee daar heb ik nog nooit van gehoord..
Maar met de beperkte middellen die we hebben moet bepaald worden welke ecoli een goed geligeerde vector heeft opgenomen. Is de fector wel goed zou deze het gfpgen bevatten en dus onder uv groen kleuren, is dit niet het geval wordt hij niet groen.

Als een bacterie meerdere vectoren heeft opgenomen waarvan maar 1 goed geligeerd is zou de kolonie toch groen kleuren terwijl de ligatie niet bij alle andere aanwezige vectoren is gelukt. Hoe bepaal je dan bij welke vectoren het is gelukt en welke niet met alleen uv straling?
De insert te klein is voor een electroforese...

#6

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 30 september 2011 - 00:09

Dat dee insert te klein voor electroforese lijkt me erg onwaarschijnlijk, ik heb laatst nog een 25bp fragment geisoleerd (moet je niet willen, maar dat is een ander verhaal). Wederom je kan door middel van restrictie analyse uitvogelen of de reincultuur de plasmide van interesse bevat of dat er ook nog andere plasmiden aanwezig zijn. Je mag er echter van uitgaan dat als je een enkele kolonie selecteert die positief is voor je gen van interesse in combinatie met een antibiotica resistentie dan je dan inderdaad met de juiste vector te maken hebt.
"Meep meep meep." Beaker





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures