Western blot

QuarkSV

Hallo

Om een bepaald eiwit te detecteren, moet ik binnenkort een Western blot uitvoeren. Er wordt in mijn practicumhandleiding uitgelegd hoe je een blotting-toestel moet klaar zetten en dit gaat samengevat als volgt:

"Leg 9 bladzijden Whatmann-papier in het blotting-toestel, leg daarboven de nitrocellulosefilter, daarbovenop plaats je de gel uit een SDS-PAGE, daarboven nog eens 9 bladzijden Whatmann-papier. Sluit het apparaat en start het blotten voor 1u op 16V"

Het volgende staat ook in de handleiding: "Mag je ook de nitrocellulosefilter bovenop de gel aanbrengen i.p.v., zoals hierboven gezegd, de gel bovenop de nitrocellulosefilter?". Met andere woorden, maakt de volgorde wat uit?

Ik denk (intuïtief) dat de blot enkel maar kan slagen als je de gel bovenop de nitrocellulosefilter brengt en niet omgekeerd zoals geïnsinueerd in de vraag hierboven, maar ik kan het niet precies verklaren...

Kan iemand me hier verder mee helpen? Ben ik correct met mijn intuïtief antwoord en/of hoe moet ik het verklaren?

Mrtn

Dat maakt zeker uit.

Wat is de lading van de eiwitten in je gel?

Hoe gaat de sandwich in het apparaat en hoe zijn de + en - polen dan georiënteerd?

QuarkSV

Wat is de lading van de eiwitten in je gel?

De eiwitten zijn negatief geladen door de SDS-PAGE.

Hoe gaat de sandwich in het apparaat en hoe zijn de + en - polen dan georiënteerd?

De 'sandwich' wordt in het apparaat geplaatst waarbij de plus-pool (anode) onderaan zit en de min-pool (kathode) bovenaan.

------

Verklaring: Aangezien de eiwitten in de gel negatief geladen zijn, zullen ze logischerwijze naar de positieve pool migreren dus naar onder. Nu ligt onder de gel, de nitrocellulosefilter dus de eiwitten zullen erin migreren. Mocht je de nitrocellulosefilter bovenop de gel leggen, dan zullen de eiwitten niet in de nitrocellulosefilter migreren want die ligt bovenop de gel en de eiwitten bewegen naar onder.

Klopt mijn uitleg?

Mrtn

Helemaal correct

Korte versie: als je de membraan aan de verkeerde kant doet, lopen je eiwitten je whatman papiertjes in en ben je ze dus kwijt.

Om deze reden hebben alle laboranten die blotjes doen een vaste volgorde om de sandwich te bouwen. De delen van de houder zijn meestal verschillend in kleur en het ding past maar op 1 manier in de transfer tub. Controleer dit 'droog' voor je begint om zo een beetje gevoel te krijgen voor de spullen. Let erop dat je de polen goed aansluit.

Pak het membraan trouwens niet met je handen vast en zorg dat alles lekker nat is (transfer buffer, geen water). De Whatman papiertjes niet laten weken in de transfer buffer want dan vallen ze uit elkaar (bij de membraan en 'kussentjes' is dit geen probleem).

QuarkSV

Bedankt voor je hulp! Ik heb vandaag de blot uitgevoerd en het liep gesmeerd

. Hopelijk detecteren we tijdens de volgende sessie (volgende week) het gezochte eiwit m.b.v. specifieke antilichamen.

Wouter_Masselink

Bij deze zogenaamde semi-droge blots is het cruciaal om er voor te zorgen dat alles inderdaad goed nat is, ook is het belangrijk om er voor te zorgen dat er nergens luchtbellen tussen je sandwich zitten. In de praktijk betekend dit een 50 mL falcon buis gebruiken als een soort mini wals.

QuarkSV

Bij deze zogenaamde semi-droge blots is het cruciaal om er voor te zorgen dat alles inderdaad goed nat is, ook is het belangrijk om er voor te zorgen dat er nergens luchtbellen tussen je sandwich zitten. In de praktijk betekend dit een 50 mL falcon buis gebruiken als een soort mini wals.

Dat hebben we inderdaad gedaan. Toen we de 'sandwich' in het apparaat legden, hebben we deze nogmaals overgoten met wat buffer zodat alles zeker goed doordrenkt was. We gebruikten ook een soort pipet als wals. Wanneer de blotting gedaan was, hebben we het nitrocellulosemembraan in wat melk gebracht zodat alle andere plaatsen in het membraan (die nog niet bezet waren door een eiwit) opgevuld werden met de eiwitten uit melk. Volgende week gaan we verder met antilichamen-detectie

.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Western blot

Western blot

Re: Western blot

Re: Western blot

Re: Western blot

Re: Western blot

Re: Western blot

Re: Western blot