Springen naar inhoud

Fenol contaminatie invloed op pcr?


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 december 2011 - 22:15

Hallo iedereen,

Momenteel ben ik bezig met het isoleren van gDNA uit bloed. Hierbij lyseer ik de cellen met 1% SDS (10 minuten op 96 graden Celcius) vervolgens doe ik twee maal een fenol/chloroform stap en precipiteer ik het DNA met isopropanol. Het pellet word opgelost in TE buffer met RNase.

Als ik het DNA spectrum vervolgens analyseer met de Nanodrop krijg ik meestal een A260/280 rond de 1,7-1,8 en de concentraties liggen vrij hoog (variërend van gemiddeld 200 - 350 ng/µL). Echter ik zie een duidelijk piek bij 270 nm, wat dus duid op contaminatie met fenol. Nu vraag ik mij af of fenol een PCR kan verstoren en of er misschien tips zijn om de fenol eruit te krijgen. Zijn misschien meerdere wasstappen met isopropanol een idee?

Alvast bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Mako

    Mako


  • >1k berichten
  • 1146 berichten
  • VIP

Geplaatst op 02 december 2011 - 23:21

Phenol/chloroform is een vrij simpele extractie methode. Zelf gebruikte ik phenol/chloroform alleen tijdens cloneringen en om in vitro RNA te verkrijgen.

Phenol/chloroform gebruiken voor een PCR is naar mijn mening een beetje te veel van het goede. Als ik jou was zou ik eerst het meest dirty protocol proberen. Mits je primers goed zijn ontworpen is een PCR meestal wel redelijk robust. Ik bedoel je kan zelfs een bacterie kolonie aanprikken en deze direct in je PCR reactie gooien. Veel viezer dan dat kan je bijna niet gaan.


Lees eventueel ook even volgend topic door, hier werd al iets gelijkaardigs besproken.
A word of encouragement during a failure is worth more than an hour of praise after success.
I hear, I know. I see, I remember. I do, I understand -Confucius-

#3

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 december 2011 - 23:34

@Mako: Ik had deze al gelezen, maar hier betreft het monsters waarbij vrij weinig eiwitten vrij komen. Dan hoeft idd niet zo'n dergelijke extractie methode uitgevoerd te worden. Echter, voor het isoleren van DNA uit bloed komen er vrij veel eiwitten vrij. Dit is ook duidelijk te zien als ik de fenol/chloroform extractie uitvoer. Ik weet dat voor PCR het niet geheel zuiver hoeft te zijn, maar zo'n dergelijke onzuiverheid van een preparaat kan ik niet gebruiken voor de PCR.

#4

Mrtn

    Mrtn


  • >1k berichten
  • 4220 berichten
  • VIP

Geplaatst op 03 december 2011 - 10:40

Als je toch zo'n hoge opbrengst hebt kan je overwegen wat opbrengst te 'offeren' door minder dicht tot de scheiding van de twee lagen te gaan.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.
-Calvin-

#5

mvbandit650

    mvbandit650


  • >25 berichten
  • 54 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2011 - 16:26

Wij gebruiken altijd Trizol voor onze isolaties. Dit gaat altijd goed. Trizol is ook op fenol basis, dus misschien zijn de was-stappen die hierin voorkomen ook geschikt voor jouw protocol.
Fenol kan inderdaad invloed hebben op je PCR reactie, maar als je een PCR op gDNA doet hoeft dit een groot probleem te zijn. Wat wil je met het gDNA gaan doen?

Hieronder het "trizol" protocol en dan vanaf de was-stappen.

1.Wash the DNA pellet with 1 mL of sodium citrate/ ethanol solution (0.1 M sodium citrate in 10% ethanol, pH 8.5)
2. Incubate for 30 minutes at room temperature. Mix occasionally by gentle inversion.
Note: The DNA can be stored in sodium citrate/ethanol
solution at least 2 hours.
3. Centrifuge at 2000 × g for 5 minutes at 4°C. Remove and discard supernatant.
4. Repeat wash (steps 1–3), once.

Note: Repeat wash twice for large DNA pellets (>200 μg).
5. Add 1.5–2 mL 75% ethanol per 1 mL of used for the initial homogenization.
Note: DNA samples may be stored in 75% ethanol at 4°C for several months.
6. Incubate for 10–20 minutes at room temperature. Mix the tube occasionally by gentle inversion.
7. Centrifuge at 2000 × g for 5 minutes at 4°C. Remove and discard supernatant.
8. Air or vacuum dry the DNA pellet for 5–10 minutes. Do not allow the pellet to dry out. Do not dry the pellet by
vacuum centrifuge.

Stap 8, doen we nooit in een vacuum-centrifuge. Het gaat erom dat de alcohol eruit verdampt is. 10 minuten op de bench is voldoende.

Hoop dat dit voor jouw toepassing geschikt is.
"Life is what happens while you are busy making other plans." - John Lennon

#6

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2011 - 16:36

@mvbandit650: Ik wil het gDNA gebruiken voor de amplificatie van een deel van een gen. Het is onderdeel van een PCR-RFLP. Dan ga ik het PCR product knippen met geselecteerde restrictie-enzymen om mutaties te analyseren door het verdwijnen/verschijnen van restrictie-sites.

Over het trizol protocol: Deze wasstappen moet ik uitvoeren na de precipitatie met isopropanol? Ik wil het namelijk meenemen in de DNA isolatie.


@mrtn: De 'hoge opbrengst' op de Nanodrop is niet betrouwbaar, omdat deze hoger lijkt dan het daadwerkelijk is door de A270 piek van fenol. Ik weet dus niet of ik daadwerkelijk een hoge opbrengst heb.


Ik heb momenteel de DNA-preparaten in TE buffer met RNase. Heeft iemand een suggestie om deze preparaten nog van fenol te kunnen ontdoen?

Veranderd door Callisto, 04 december 2011 - 16:36


#7

mvbandit650

    mvbandit650


  • >25 berichten
  • 54 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2011 - 18:39

@mvbandit650: Ik wil het gDNA gebruiken voor de amplificatie van een deel van een gen. Het is onderdeel van een PCR-RFLP. Dan ga ik het PCR product knippen met geselecteerde restrictie-enzymen om mutaties te analyseren door het verdwijnen/verschijnen van restrictie-sites.


Hoe groot is het gen dat je wil PCR-en? De amplificatie zal wel lukken, misschien alleen minder efficient als er nog fenol bij zit. Fenol geeft volgens mij meer problemen bij RT qPCR waarbij men de genexpressie wil weten tussen verschillende genen. Als daar fenol bij zit kan door een lagere efficientie er een lagere expressie uitkomen wat niet juist is.

Over het trizol protocol: Deze wasstappen moet ik uitvoeren na de precipitatie met isopropanol? Ik wil het namelijk meenemen in de DNA isolatie.

Inderdaad, na de precipitatie. Zie anders de volgende PDF TRIZOL manual
"Life is what happens while you are busy making other plans." - John Lennon

#8

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2011 - 18:44

@mvbandit650: Het PCR product is 661 bp. Ik wil er geen RT-/qPCR mee uitvoeren. Overigens, bedankt voor de link naar het Trizol pdf!

#9

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 december 2011 - 00:26

De fenol had je bij je eerste stap (toevoegen van fenol/chloroform/isoamylalcohol) al kwijt moeten raken. Je voegt je f/c/i toe, mengt alles, draait af en neemt alleen de bovenste laag op. Het is heel belangrijk om niks van de onderste laag (fenol) mee te nemen. Niet alleen zit je met de fenol, ook heb je de eiwitten die hier in zitten dus ook meteen te pakken.

Het is belangrijk om fenol op de juiste pH te hebben. Als je pH rond de 5 is zal het DNA in de fenol fase belanden en niet in je chloroform.

Zelfs na volledige isolatie (en oplossen in buffer) zou je alles af kunnen draaien en dan zou je een scheiding van je fenol moeten kunnen zien.
"Meep meep meep." Beaker

#10

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 december 2011 - 00:32

De fenol had je bij je eerste stap (toevoegen van fenol/chloroform/isoamylalcohol) al kwijt moeten raken. Je voegt je f/c/i toe, mengt alles, draait af en neemt alleen de bovenste laag op. Het is heel belangrijk om niks van de onderste laag (fenol) mee te nemen. Niet alleen zit je met de fenol, ook heb je de eiwitten die hier in zitten dus ook meteen te pakken.


Ik ben op de hoogte hoe dit principe werkt. Ook ben ik heel zeker dat er niks van de onderste laag is meegekomen. Ik heb expres een gedeelte van de bovenste laag laten zitten om te voorkomen dat er fenol in komt. Echter, dit is toch gebeurd blijkbaar (in alle 10 DNA isolaties) en nu wil ik weten hoe ik dit in de toekomst kan voorkomen en hoe ik de fenol in mijn huidige gDNA-preparaten kan verwijderen.

Verder is er geen piek bij A280 te zien, waardoor ik dus weet dat er (vrijwel) geen eiwitten meegekomen is in mijn gDNA-preparaten.

Ik heb nu een voorstel gehad om nog een extra stap met alleen chloroform/isoamylalcohol toe te voegen om de fenol kwijt te raken. Iemand ervaring of de 'waterige laag' goed te onderscheiden is?

#11

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 05 december 2011 - 23:58

Ik ben op de hoogte hoe dit principe werkt. Ook ben ik heel zeker dat er niks van de onderste laag is meegekomen. Ik heb expres een gedeelte van de bovenste laag laten zitten om te voorkomen dat er fenol in komt. Echter, dit is toch gebeurd blijkbaar (in alle 10 DNA isolaties) en nu wil ik weten hoe ik dit in de toekomst kan voorkomen en hoe ik de fenol in mijn huidige gDNA-preparaten kan verwijderen.

Verder is er geen piek bij A280 te zien, waardoor ik dus weet dat er (vrijwel) geen eiwitten meegekomen is in mijn gDNA-preparaten.

Ik heb nu een voorstel gehad om nog een extra stap met alleen chloroform/isoamylalcohol toe te voegen om de fenol kwijt te raken. Iemand ervaring of de 'waterige laag' goed te onderscheiden is?


Er had geen phenol mee moeten komen, heeft iemand anders in het labo ook deze phenol/chloroform gebruikt en werkt het bij deze persoon wel? anders begin ik te twijfelen of de chemicalien nog wel in orde zijn (om wat voor reden dan ook). Phenol/Chloroform zou gewoon moeten werken.

Nog een keer Chloroform/isoamyl toevoegen kan in principe geen kwaad.
"Meep meep meep." Beaker

#12

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 februari 2012 - 21:36

Meerdere personen in het lab hebben onafhankelijk dit protocol gebruikt en ook hun krijgen fenol in de DNA preparaten. Inmiddels is de fenol achterwege gelaten en word die stap alleen uitgevoerd met chloroform/isoamylalcohol. Dit verwijderd te fenol contaminatie uiteraard, echter is er nog chloroform/isoamylalcohol te ruiken in je DNA preparaat zelfs na een precipitatie stap, wassen met 70% ethanol (2x) en oplossen van het DNA in TE buffer. Jammer genoeg zijn we nog steeds niet in staat geweest het protocol zo te optimaliseren dat de DNA preparaten reproduceerbaar PCR producten opleveren. Het lijkt alsof er 'random' op bepaalde DNA preparaten wel/niet PCR product gevormd kan worden, bij herhaalde PCR op dezelfde DNA preparaten krijg je dezelfde PCR uitslagen. Qua A280/260, DNA concentratie etc. lijkt er wel gelijkenis te zijn.

#13

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8252 berichten
  • VIP

Geplaatst op 12 februari 2012 - 11:20

Phenol achterwege laten lijkt me niet verstandig. Hiermee verander je het gehele protocol. Zeker als het ook bij andere personen gebeurd zou ik willen stellen dat er dus iets mis is met de chemicalien die je gebruikt. Kijk eens of je bij een nabuurig lab de isolatie eens zou kunnen proberen.
"Meep meep meep." Beaker

#14

Themisto

    Themisto


  • >25 berichten
  • 86 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 april 2012 - 13:13

Na controle van de chemicaliën is inderdaad gebleken dat de fenol over datum was. Normaal is dit te zien doordat fenol langzaamaan van een gele, naar oranje en vervolgens roze kleur overgaat. Echter, konden wij dit niet goed onderscheiden daar we niet zo vaak met fenol werkten. Onze fenol was al oranje en we zagen dit als 'donkergeel'. Het probleem is opgelost, en ik dank jullie voor jullie feedback.

Overigens kan ik melden dat dit DNA isolatie protocol voor het verkrijgen van DNA uit buffy coat zo'n hoge en zuivere opbrengst heeft opgeleverd, dat deze als een standaard protocol wordt meegenomen in het curriculum van het practicum moleculaire biologie van onze opleiding.

#15

WendyTje

    WendyTje


  • >250 berichten
  • 773 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 april 2012 - 13:37

Hoewel het al opgelost is, wil ik toch nog even vermelden dat ik om fenolcontaminatie te voorkomen altijd een phase lock tube gebruikte, wat gewoon een eppie is met een gel erin, dat je commercieel koopt. De gel gaat tussen je fenol en je waterlaag zitten,dus je kunt elke druppel van je waterlaag afpipetteren, en je neemt nooit fenol mee. Heel fijn!
To boldly go where I`ve never been before

Be nice to nerds, chances are you`ll end up working for one





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures