Pmal bacteriële expressie systeem: inductie expressie van 2 eiwitten

Moderator: ArcherBarry

Reageer

Bericht 09-02-'12, 23:22

Themisto

Gebruikersavatar
Berichten: 87

Pmal bacteri

Ik heb getracht het protocol voor de inductie van expressie van een fusie eiwit m.b.v. het pMAL-c4X bacteriële expressie systeem na te volgen om te controleren of het te reproduceren was met de middelen die we bij ons op het laboratorium hadden. De bedoeling was om niet een insert in de vector in te bouwen, en dus geen Maltose Binding Protein(MBP)-Protein X fusie eiwit tot expressie te laten komen, maar alleen de expressie van MBP (wat een MW heeft van 42,5 kDa) in de gebruikte E.Coli JM109 stam. Bij controle met een SDS-PAGE (zie bijgevoegde figuur) lijkt het alsof er twee eiwitten tot expressie zijn gebracht na inductie met behulp van IPTG: het verwachtte MBP met een MW van 42,5 kDa en een onbekend eiwit wat migreert vlak onder het referentie eiwit Bovine Serum Albumine (BSA) met een MW van 66 kDa. Dit heb ik overigens gebaseerd op de intensiteit van de twee bandjes, welke hoger bleek te zijn in het geinduceerde celextract. Is iemand hier misschien bekend mee of heeft er iemand suggesties wat hiervan de reden kan zijn?

Laan 1: Ovalbumine (MW = 45 kDa)

Laan 2: Ovalbumine (MW = 45 kDa)

Laan 3: Ongeinduceerd celextract (opgelost in 100 uL sample buffer, 20 uL opgebracht)

Laan 4: Mark12 Protein Marker

Laan 5: Geinduceerd celextract (opgelost in 50 uL sample buffer, 20 uL opgebracht)

Laan 6: Trypsine Inhibitor (MW = 21 kDa)

Laan 7: BSA (MW = 66 kDa)

Laan 8: Lysozym (MW = 14,3 kDa)

Afbeelding
Omhoog

Bericht 10-02-'12, 12:34

Mrtn

Gebruikersavatar
Berichten: 4.220

Re: Pmal bacteri

Je antilichaam heeft nogal a-specifiek gebonden (zie laantje drie) en voor zover hierop te zien is, zit je 'onbekende eiwit' in laantje drie én vier. Ik denk niet dat je zomaar mag concluderen dat er nog een eiwit is. Eerst zou ik het blotje proberen te optimaliseren / opschonen door condities te variëren.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.

-Calvin-
Omhoog

Bericht 10-02-'12, 21:28

Themisto

Gebruikersavatar
Berichten: 87

Re: Pmal bacteri

Je antilichaam heeft nogal a-specifiek gebonden (zie laantje drie) en voor zover hierop te zien is, zit je 'onbekende eiwit' in laantje drie én vier. Ik denk niet dat je zomaar mag concluderen dat er nog een eiwit is. Eerst zou ik het blotje proberen te optimaliseren / opschonen door condities te variëren.


Dit is geen western blot, dit is gewoon een SDS-PAGE en er is geen sprake van antilichaam binding.
Omhoog

Bericht 11-02-'12, 01:42

Themisto

Gebruikersavatar
Berichten: 87

Re: Pmal bacteri

Daarbij heb je de beschrijving van de lanen ook niet goed gelezen. Hoe kan mijn 'onbekende eiwit' in laan 3 én 4 aanwezig zijn... als laan 4 de Mark12 Protein Marker is? Alvorens een antwoord te plaatsen raad ik toch wel aan mijn beschrijving goed door te lezen.
Omhoog

Bericht 11-02-'12, 14:34

Mrtn

Gebruikersavatar
Berichten: 4.220

Re: Pmal bacteri

Excuus voor de verwarring, dat moet laantje drie en vijf zijn.

Even zien of ik je goed begrijp: die dikke smeer in laantje vijf die net een kleinere MW lijkt te hebben dan BSA is het 'verdachte' bandje waar je er twee in ziet?

Waarom heb je 6, 7 en 8 eigenlijk mee laten lopen?
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.

-Calvin-
Omhoog

Bericht 11-02-'12, 18:56

Themisto

Gebruikersavatar
Berichten: 87

Re: Pmal bacteri

Even zien of ik je goed begrijp: die dikke smeer in laantje vijf die net een kleinere MW lijkt te hebben dan BSA is het 'verdachte' bandje waar je er twee in ziet?
Klopt, alleen begrijp ik niet wat je bedoeld met 'waar je er twee in ziet'
Waarom heb je 6, 7 en 8 eigenlijk mee laten lopen?
Zowel lanen 1, 2 als 6, 7 en 8 zijn referentie eiwitten, aangezien ik verwachtte dat Mark12 (laan 4) niet helemaal mooi op de SDS-PAGE te zien zal zijn. Er was hier zeer weinig van en jammer genoeg kon er nergens van deze marker meer gevonden van worden. Dus op basis van die referentie eiwitten en hun MW's, kan ik nog enigszins plaatsen waar ik verwachtte het bandje van Maltose Binding Protein (MBP) te zien. Jammer genoeg is precies op die plek een soort van 'lijn' door de gel heen gelopen.
Omhoog

Bericht 11-02-'12, 22:28

Mrtn

Gebruikersavatar
Berichten: 4.220

Re: Pmal bacteri

Bij controle met een SDS-PAGE (zie bijgevoegde figuur) lijkt het alsof er twee eiwitten tot expressie zijn gebracht na inductie met behulp van IPTG: het verwachtte MBP met een MW van 42,5 kDa en een onbekend eiwit wat migreert vlak onder het referentie eiwit Bovine Serum Albumine (BSA) met een MW van 66 kDa.
Zou je pijlen kunnen tekenen bij de twee bandjes? Ik zie niet zo veel bandjes in 5 die in drie niet te zien zijn.
Of course, the theory of relativity only works if you're going west.

-Calvin-
Omhoog

Bericht 12-02-'12, 11:00

Themisto

Gebruikersavatar
Berichten: 87

Re: Pmal bacteri

Ik kan je die pijlen wel tekenen, maar dat geeft nog niet zoveel toegevoegde waarde. Je moet bedenken dat dit een gelyseerd celextract is. Zowel in laan 3 als 5. Je zal hoe dan ook geen specifiek bandje aantreffen 'wat er eerder niet was'. Het grote verschil met die twee is dat er twee bandjes met een hogere intensiteit naar voren komen in 5 dan in 3, want indiceert dat er twee eiwitten tot expressie zijn geinduceerd nadat er IPTG werd toegevoegd. Maar het gaat overigens om één bandje, die vlak onder de MW van BSA (66 kDa) migreert. De vraag is of iemand bekend is dat er nog een ander eiwit tot expressie kan komen in een E.Coli JM109 na toevoeging van IPTG.

Afbeelding
Omhoog
Reageer

Terug naar “Moleculaire biologie en biochemie”