Springen naar inhoud

Eiwit zuiverheid adhv HPLC


  • Log in om te kunnen reageren

#1

DanD

    DanD


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 22 maart 2005 - 21:13

Zou iemand mij kort kunnen uitleggen hoe men HPLC toepast om de zuiverheid van een eiwit te bepalen?

Indien je iets meer afweet over peptide mapping, oligosaccharide mapping en potency testen, mag je mij hierover ook informeren. Ik vind niet onmiddelijk een korte en bondige uitleg op het net. Ben ondertussen ook terug in oude cursussen aan het snuffelen, maar het is al een tijdje geleden :)

Thanx

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

JeroenCV

    JeroenCV


  • >1k berichten
  • 1153 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 maart 2005 - 09:28

Om te beginnen je eerste vraag:

nou om de zuiverheid aan te tonen kan men met LC een meting doen. Zie je dan 1 piek is de kan groot dat je eiwit zuiver is.

ZIe je meedere pieken is het niet zuiver...het kan dan ook bestaan uit meerdere subunits die samen 1 eiwit vormen.

Als je een MS er aan vast hangt krijg je een mooie envellope van meer voudig geladen pieken.

Als je onzuiverheden hebt, zie je die zeker tergu in je MS spectra.


Dan de rest:
Wat wil je weten over sequencing? Wat weet je al?

#3

DanD

    DanD


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 23 maart 2005 - 19:00

Wel, het is niet zozeer het sequeneren van het peptide, maar wel peptide mapping. Of verstaat men hieronder hetzelfde. Ik denk dat het ťťn weinig nut heeft zonder het ander of vergis ik mij hierin?

Wat ik mij kan herinneren is dat men bij peptide mapping eiwitten gaat scheiden vai IEF (pH gradient aanleggen en eiwitten laten migreren tot hun lading neutraal is) en vervolgens gaat men ze scheiden via SDS-PAGE op basis van hun grootte.

Dan denk ik dat men de eiwitten van interesse uit de gel extraheert om ze vervolgens met HPLC te analyseren. Het eiwit zal na analyse een piekpatroon vertonen. Dit patroon kan men vergelijken in een database om zo de sequentie op te sporen of indien er niets in de database vermeld staat, dient men het eiwit te sequeneren.

Hoe die sequenering tegenwoordig gebeurd? Mij zegt enkel de Edman degradatie iets en meer bepaald de gasfase sequenator gebaseerd op dit principe. Maar hoe dit tegenwoordig gebeurd?

De potency test doet mij vermoeden dat het om een test gaat :) die de activiteit nagaat van het eiwit, maar hoe men dit nagaat?

Alvast bedankt voor het snelle antwoord...het is uiterst welkom

grtz

#4

Gideon

    Gideon


  • Chemiefoum.nl erelid
  • 337 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 maart 2005 - 19:00

Sequencen kan idd met Edman's degradatiemethode maar volgens mij kan je niet meer dan 100 aminozuren nauwkeurig bepalen.

Tegenwoordig gebeurt dit o.a. met MSxMS... Een eiwit wordt al op voorhand gezuiverd met bijv. een 2D gel, uitgesneden en door de massaspectrometer gebracht, welke de eiwitten op massa scheidt (ik weet niet de eiwitten dan al met trypsinise voorbehandeld zijn), in de 2e dimensie MS worden individuele aminozuren van het eiwit bepaalt (volgens mij met behulp van amine-groep linkers)

De ontwikkelingen hierin gaan razendsnel, dus er komen binnenkort vast nog wel nieuwe mensen

#5

DanD

    DanD


  • 0 - 25 berichten
  • 20 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 24 maart 2005 - 22:15

We komen er wel, alvast bedankt Gideon

#6

cheMister

    cheMister


  • >250 berichten
  • 266 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 maart 2005 - 16:55

Is de molecuulmassa van een eiwit niet wat te groot voor HPLC of vergis ik mij.
Kun je dit niet beter doen met gelfiltratie?

#7

bteunissen

    bteunissen


  • >1k berichten
  • 1122 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 maart 2005 - 17:47

Is de molecuulmassa van een eiwit niet wat te groot voor HPLC?


Niet als je een size exclusion kolom gebruikt.
In het geval van NP of RP HPLC is de poriegrootte idd te klein voor grote moleculen als eiwitten..

Grtz Bas

#8

keyzplayer

    keyzplayer


  • >100 berichten
  • 115 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 maart 2005 - 21:16

Er zijn tegenwoordig kolomboeren die beweren een kolom te verkopen die de eigenschappen van een size exclusion kolom en een RP kolom combineren.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures