Springen naar inhoud

Denaturatie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

bteunissen

    bteunissen


  • >1k berichten
  • 1122 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 april 2005 - 09:55

Hallo,

Ik vraag mij af wat precies het verschil is tussen denaturatie en precipitatie van eiwitten. Bij denaturatie wordt de tertiaire structuur van het eiwit verbroken onder invloed van hoge of lage pH waarden of hoge temperaturen en dat heeft volgens mij precipitatie tot gevolg, of niet altijd? Zijn er naast denaturatie ook andere manieren om eiwitten te precipiteren?
Tweede vraag: Denaturatie is voor zover ik weet (soms) een omkeerbaar proces, is precipitatie dit dan misschien niet?

De twee termen zijn nogal verwarrend vind ik. ;)
Als je bijvoorbeeld een bloed monster hebt en je wilt de eiwitten er uit verwijderen. Denatureer je de eiwitten om ze vervolgens af te filtreren of precipiteer je ze om ze vervolgens ook af te filtreren?

Grtz Bas

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 april 2005 - 10:21

precipitatie: hierbij sla je het eiwit neer in een oplossing. Door deze methode kun je het eiwit uit een oplossing halen met behulp van een neerslag reactie en een centrifuge stap. Hierbij ontstaat een pellet en schenk je de oplossing er vanaf. Dit kunje ook met nucleotide zuren doen zoals RNA en DNA. Hierbij sla je deze bestandsdelen neer met een zoutoplossing. Het RNA dan wel DNA blijft intact en is nog steeds goed te gebruiken.
denaturatie: de eiwitten behouden hun structuur niet meer door extrene factoren zoals hitte dan wel zuren en basen. Het gevolg dat het eiwit zijn functie verlies. Ik weet niet zeker of je ze kunt terug vouwen.

MvG Ron

#3

JeroenCV

    JeroenCV


  • >1k berichten
  • 1153 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 april 2005 - 11:46

denaturatie bestaat uit 3 stappen:

1. Ontvouwing: de tertaire structuur wordt ontdaan.
2. Reducering: de SH-bruggen worden verbroken
3. Methylering: aan de reactive SH groepen van de cysteines komt een groep te zitten. Dit wordt vaak gedaan met joodacetamide. Dit wordt gedaan om terugvouwing tegen te gaan.

Hieruit volgt meteen het antwoordt: als je een volledige denaturatie uitvoerd zal een eiwit niet zomaar terug vouwen. als je Alleen ontvouwt, in bv 6 M urea, kan je eiwit wel terugvouwen.

Voor de uitleg van precipitatie kan ik weinig toevoegen.

#4

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 april 2005 - 12:20

als je een volledige denaturatie uitvoerd zal een eiwit niet zomaar terug vouwen. als je Alleen ontvouwt, in bv 6 M urea, kan je eiwit wel terugvouwen.


Dat van het urea ben ik van op de hoogte wordt bij ons op het lab veel toegepast.
Maar even terugvallen op die volledige denaturatie. Hoe snel gebeurd dit en welke invloeden hebben nu het meeste effect hier op? Ik ben benieuwd naar optimums en minimums. Ik werk namelijk nogal veel met eiwitten en ik vroeg me af waar een eiwit nog net tegen kan en wanneer dit proces wordt in gezet. En als je eiwit bewaard bij +4 graden hoelang blijft het dan in take?
Eiwit denatureert snel boven 50 graden geloof ik, maar de pH effecten dan?

Veranderd door biochemiefreak, 25 april 2005 - 12:21


#5

JeroenCV

    JeroenCV


  • >1k berichten
  • 1153 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 april 2005 - 13:45

Maar even terugvallen op die volledige denaturatie. Hoe snel gebeurd dit en welke invloeden hebben nu het meeste effect hier op?

tja daar vraag je wat. Ik kan niet volledig antwoord geven. Het grootste probleem is dat het helemaal van het eiwit afhangt.

Stel ik neem myoglobine. Niet echt groot, 17kDa, en geen SH-bruggen. Echter het ontvouwen hiervan neemt wel wat tijd in beslag. (1 uur in het donker op 58 graden celcius)

Maar BSA, wat groter 65kDa 35 SH-bruggen ontvouwt al door er naar te kijken, bij wijze van spreken.

Wat ik zelf meestal doe is ik neem een eiwit. ontvouw dit met Rapigest 1 uur in het donker bij 58 graden Celsius onder invloed van wat bis-2-mercaptosulfone (BMS). Daarna laat ik de mix afkoelen en stop er wat joodacetamide bij en zet het weg in een waterbad bij 37 graden gedurende 30 minuten. Dan is het meestal goed genoeg voor een digestie uit te voeren.

En als je eiwit bewaard bij +4 graden hoelang blijft het dan in take?
Eiwit denatureert snel boven 50 graden geloof ik, maar de pH effecten dan


Ja ook dit hangt van je eiwit af. Aangezien niet ieder eiwit stuk zal gaan bij 50 graden. (de meeste wel hoor!!!) De pH effecten zijn wat anders, meestal wordt zo'n pH effect gebruikt om een eiwit te laten neerslaan. dus bij precipitatie. Misschien kan je daar wat meer vinden in literatuur.

grt
JC

#6

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 april 2005 - 14:49

Ik isoleer antilichamen met behulp van een FPLC Hitrap kolom. Dit zijn IgG antilichamen en ik haal ze van het kolom bij een pH van 2.7. Deze waarde is veelste laag voor het eiwit. Daarom voeg ik 1 M Tris buffer met pH van 9 er bij. Ik weet niet hoe stabiel het eiwit blijft bij een pH van 2.7 maar voeg ik het er niet bij dan krijg ik toch echt een probleem met het eiwit.
Maar inderdaad precipitatie wordt vaak gedaan met een zure oplossing zoals TCA en dat is behoorlijk zuur spul zit zwavelzuur in.
Maar dat het aanhet type eiwit ligt dat kan ik me heel goed voorstellen. ;) Dan speelt de primaire, secondaire en tertaire en zwavelbindingen een belangrijke rol.

MvG Ron





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures