Preparatieve HPLC

Chemical Brothers

Voor een schoolproject moeten we de twee werkzame stoffen in een medicijn van elkaar scheiden. De opdracht is dat we dat met preparatieve HPLC doen. Het probleem is alleen; hoe kan je het juiste aantal nm vinden waarop je de detector moet zetten?

In het beste geval lossen we de stof op in eluens en nemen er daarna een absorptiespectrum van op en krijgen we 1 piek te zien. Hierop stellen we de detector in en we krijgen netjes twee pieken te zien nadat de stof door de HPLC is gegaan.

Andere mogelijkheid is dat we nadat we het absorptiespectrum opgenomen hebben twee pieken te zien krijgen, dan moeten we twee series runs draaien met de HPLC, een serie waarbij we de ene stof kunnen zien en opvangen, en een serie voor de andere stof.

In het slechtste geval krijgen we nadat we het absorbtiespectrum hebben opgenomen maar 1 piek te zien, maar is deze piek het effect van twee gemengde stoffen. Voorbeeld: Piek zit bij het absorptiespectrum op 400nm, terwijl stof 1 zijn piek op 300nm zit, en stof 2 zijn piek op 500nm. In dit geval zal er niets te zien zijn nadat we de stof door de HPLC hebben laten lopen.

Nu dachten we een algemene oplossing bedacht te hebben: we draaien eerst een run waarbij we iedere minuut of halve minuut de fracties die uit de HPLC komen verzamelen in een andere cuvet, waarna we van elke cuvet een absorptiespectrum opnemen. Zo kan je een plaatje maken waar Absorptie, nm en retentietijd tegen elkaar uitstaan en kan je zien welke stof welk absorbtiemaximum heeft. Dit kan echter maar globaal worden bepaalt, maar dit is niet erg, want als we de stoffen goed gescheiden krijgen dan kunnen we dan precies het absorptiemaximum bepalen.

Nadeel is dat bovenstaande methode vrij lang duurt. Op deze manier zijn we alleen al een halve labdag kwijt aan het bepalen van de "ongeveer" juiste detectiegolflengte. De vraag is dus, hoe wordt dit probleem normaal opgelost? Heeft iemand hier al ervaringen mee?

Beryllium

Het eerste zou ik gewoon kijken of je stoffen een overlappende piek hebben. Meet dus absorptiespectra van beide stoffen die apart in een oplossing zitten. Dat is de eenvoudigste oplossing, en hoef je niet direct moeilijk te gaan doen met opvangen van losse fracties.

Meet daarnaast ook een blanco van je eluens mee!!

Het meest waarschijnlijk zal je absorptie in het UV tegenkomen (<400 nm). Dat is een algemeen gebied voor absorptie van stoffen met aromatische groepen (zoals die veel in medicijnen voorkomen).

Het opvangen van de fracties is niet praktisch en ook niet erg nuttig, je hebt een detectiemethode nodig die allebei de stoffen aankan.

Chemical Brothers

Het eerste zou ik gewoon kijken of je stoffen een overlappende piek hebben. Meet dus absorptiespectra van beide stoffen die apart in een oplossing zitten.

Dat is onderdeel van het probleem, de twee stoffen die moeten we juist scheiden om ze te kunnen identificeren. We weten nog niet welke stoffen het zijn, en kunnen dus ook niet de absorptie-maxima van te voren meten. Maar we kunnen ze nog niet scheiden, omdat we niet de juiste absorptie-maxima weten.

DrQuico

Is het niet zo dat een HPLC de absorbtie over het hele UV/Vis gebied meet zodat je bij de uitwerking van je chromatochram de optimale golflengte(s) kan kiezen?

Of is het een ouderwets apparaat waarbij je van te voren een golflengte moet kiezen?

Chemical Brothers

Of is het een ouderwets apparaat waarbij je van te voren een golflengte moet kiezen?

Het is zo'n ouderwets kreng... 8-[

Napoleon1981

DrQuico bedoeld een diode array detector. Deze detector neemt continue een heel spectrum op. Als resultaat onstaat een 3d plaatje, zoals jij dus met de hand wilt gaan maken 8-[ . Als je een massa spectrometer tot je beschikking hebt, neem hem!!!!!!!!!!!!!!!

Als begin golflengte zou ik eens 254nm nemen. Nog helemaal niet moeilijk doen en dit gewoon eerst eens proberen. Een bnzeenring absorbeerd bij 254nm en komt zeer vaak voor zoals berrylium al zegt. Elektronen zuigende/donerende groepen of extra dubbelebindingen verplaatsen het maximum. Gelukkig zijn in dit geval absorptie spectra zijn zo breed dat je altijd wel wat ziet rond deze golflengte

rwwh

In het slechtste geval krijgen we nadat we het absorbtiespectrum hebben opgenomen maar 1 piek te zien, maar is deze piek het effect van twee gemengde stoffen.

Waarom is dat slecht? Wat kun je in dit geval niet?

Chemical Brothers

DrQuico bedoeld een diode array detector. Deze detector neemt continue een heel spectrum op. Als resultaat onstaat een 3d plaatje, zoals jij dus met de hand wilt gaan maken 8-[ .

Ah, kijk, zoiets zocht ik, nu nog hopen dat we dat hebben op school... Morgenochtend even vragen, ik laat morgen nog wel weten of we er een hebben.

Waarom is dat slecht? Wat kun je in dit geval niet?

Stel stof 1 heeft een absorptiemaximum van 300nm, stof 2 een van 500nm. Als je deze twee combineert kan het zijn dat je een stof krijgt die een absorptiemaximum heeft van 400nm. Dus dan los je de stof op, neem je een absorptiespectrum, bepaal je het het maximum (in dit voorbeeld 400nm) en je stelt de detector van de HPLC in op 400nm. Vervolgens laat je de de stof door de HPLC lopen, je ziet alleen niets eruit komen, omdat stof 1 en stof 2 nu gescheiden zijn en alleen licht met een grootte van 300 of 500nm absorberen. Daarom is het "slecht".

Napoleon1981

Toch vind ik je opdracht bijzonder vreemd. Als je niet weet wat je gaat analyseren, hoe kies je dan je kolom, eluens en monster voorbereiding? Waarom kies je voor RP-HPLC?

Trouwens dat van die 2stoffen werkt niet zo. Als ze niet reageren dan zie je de 2spectra bij elkaar opgeteld! Dan pak je een maximum en doe je een run, is het niet goed pak je weer een ander. Zo ga je gericht te werk! Verder probeer gewoon die 254nm voor je moeilijk gaat doen. Ik weet bijna zeker dat je dan goed zit

rwwh

Stel stof 1 heeft een absorptiemaximum van 300nm, stof 2 een van 500nm. Als je deze twee combineert kan het zijn dat je een stof krijgt die een absorptiemaximum heeft van 400nm.

Nee, dat kan alleen als er een reactie of een complexatie tussen die twee zit, en dan is het wel erg toevallig dat de golflengte ertussenin zit. (Probeer maar eens een concreet voorbeeld te geven als je denkt dat ik ongelijk heb). Als twee stoffen met een pi-systeem met elkaar tot een groter pi-systeem reageren, is de absorptiegolflengte groter dan de grootste van de twee originelen.

Bovendien zou het ook wel erg sterk zijn als dat reversibel was. Als die stoffen zo aan elkaar zouden plakken zouden ze waarschijnlijk ook gezamenlijk van de kolom komen.

Napoleon1981 (de expert) zegt het al: maak je niet te sappel.

Chemical Brothers

Toch vind ik je opdracht bijzonder vreemd. Als je niet weet wat je gaat analyseren, hoe kies je dan je kolom, eluens en monster voorbereiding? Waarom kies je voor RP-HPLC?

Tja, Inholland he? 8-[ We vonden zelf de opdracht ook al vreemd...

Gelukkig staat in de opdracht dat dat het gaat om "twee zwak zure verbindingen, die op een RP-18 kolom te scheiden zijn". Om te beginnen nemen we een eluens van 50/50 v/v% water methanol, als de pieken elkaar overlappen dan kunnen we dit later nog aanpassen. De keuze voor preparatieve HPLC is (jammergenoeg) onderdeel van de opdracht. Zelf had ik het leuker en uitdagender gevonden als je helemaal zelf de methode mocht ontwikkelen, maar dat zit er niet echt in.

Het advies dus: Kijken of er een diode array detector aanwezig is, anders niet te sappel maken en op 254nm meten.

Beryllium

Ik vind je verhaal lastig te volgen, maar volgens mij maak je een denkfout.

Stel stof 1 heeft een absorptiemaximum van 300nm, stof 2 een van 500nm. Als je deze twee combineert kan het zijn dat je een stof krijgt die een absorptiemaximum heeft van 400nm.

Nee, als je ze combineert krijg je een absorptiespectrum met twee maxima: één op 300, één op 500 nm.

neem je een absorptiespectrum, bepaal je het het maximum (in dit voorbeeld 400nm) en je stelt de detector van de HPLC in op 400nm. Vervolgens laat je de de stof door de HPLC lopen, je ziet alleen niets eruit komen, omdat stof 1 en stof 2 nu gescheiden zijn en alleen licht met een grootte van 300 of 500nm absorberen.

Als je het maximum bepaalt op 400 nm kan dat in je HPLC niet opeens verschoven zijn.

In het voorbeeld dat je geeft kan je misschien idd wel 400 nm gebruiken. Het is niet het belangrijkste om te meten in het absorptiemaximum van een stof, waar het om gaat is dat je een golflengte kiest waar beide stoffen elk voldoende absorberen om zichtbaar te maken.

Met behulp van een ijklijn kan je dan concentraties gaan bepalen.

rwwh

Met behulp van een ijklijn kan je dan concentraties gaan bepalen.

Voor nauwkeurige kwantitatieve bepalingen moet je echter toch op een piek centreren. Als je op de flank zit, en de ingestelde golflengte verloopt een klein beetje door omgevingsinvloeden, verstoort dat je ijklijn. Op het maximum is de eerste afgeleide in elk geval klein.

In dit geval is dat inderdaad geen probleem, en zal op de flank alleen de detectielimiet wat lager worden.

Napoleon1981

Nog maar een tip, waarom methanol/water? Je hebt zure verbindingen dus proton donors, net als methanol....... Normaal gesproken neem je dan acetonitril een proton acceptor.

En heb je al over de buffer nagedacht?

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Preparatieve HPLC

Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC

Re: Preparatieve HPLC