Springen naar inhoud

Gradient elutie omzetten naar Isocratisch elutie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Jane_CF

    Jane_CF


  • >25 berichten
  • 50 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 mei 2005 - 11:19

In de literauur is het volgende gegeven:

Loopvloeistof:
A= water + 1% 0,1 N-fosforzuur;
B= Acetonitril + 1% 0,1 N-foforzuur.

Gradient:
5-25% lineair in 20 min.

Flow:
1,0 ml/min

Detectie:
UV 330 nm

Injectievolume:
3 microliter

Kolom= RP C18 kolom

De stof is polair en heeft 11 OH-groepen.
Hoe moet ik dit aanpakken?
Waarmoet ik op letten? Welke parameters zijn het belangrijkst dus welke hebben de meeste invloed op de scheiding?
Wat voor invloed heeft de pH op deze scheiding.
Ik ben bekend met de simplexmethode maar dit is toch een optimalisatie methode?

Veranderd door Jane, 23 mei 2005 - 13:07


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 mei 2005 - 12:45

Hoe moet ik dit aanpakken?


Je hebt de methode al beschreven. Een literatuur voorschrift zou ik gewoon eerst een kopieren en dan bij gaan schaven mocht het niet optimaal functioneren. In jouw geval is het een redelijk gedetailleerd voorschrift dus dat zou in je voordeel kunnen werken. Vervang je gradient eerst eens door 20 a 25% acetonitriel. Je moet er wel zeker ven zijn dat alles van je kolom komt. Welke stoffen worden er in het voorschrift geanalyseerd? In welke ben jij geinteresseerd? Je matrix speelt een essentiele rol hierin. Een gradient wordt vaak gebruikt wanneer iemand in meerdere stoffen is geinteresseerd die een nogal verschillend karakter hebben. Is dit bij jou ook het geval?

Wat voor invloed heeft de pH op deze scheiding.


Zitten er zuregroepen in je analiet? Je buffert met fosforzuur dus je buffert heel erg laag. Zijn de OH groepen die je beschrijft van een COOH groep, of is het een phenol achtig iets? Het nadeel van zo laag bufferen is dat je alle andere zuren in je matrix ook in de ongeladen vorm krijgt, waardoor je deze op je kolom zult moeten scheiden. Kun je wat meer vertellen over de matrix en analiet (waaronder dus ook pKa waarden etc).

Welke parameters zijn het belangrijkst dus welke hebben de meeste invloed op de scheiding?


Het systeem is zo sterk als de zwakste schakel. Het is niet te zeggen wat het belangrijkste is, dan was het vak ook wel erg simpel geweest ;). Wanneer je problemen tegen komt, heeft het met de aard van het probleem te maken wat je zult moeten veranderen.

Ik ben bekend met de siplexmethode maar dit is toch een optimalisatie methode


Wat is je vraag? De siplex methode is inderdaad een manier van optimaliseren net als een factorial design etc.

Veranderd door Napoleon1981, 23 mei 2005 - 13:25


#3

Jane_CF

    Jane_CF


  • >25 berichten
  • 50 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 mei 2005 - 14:18

Hallo Napoleon1981,

Je hebt de methode al beschreven. Een literatuur voorschrift zou ik gewoon eerst een kopieren en dan bij gaan schaven mocht het niet optimaal functioneren. In jouw geval is het een redelijk gedetailleerd voorschrift dus dat zou in je voordeel kunnen werken



Bedoel je dat ik bijvoorbeeld met de eluens samenstelling van 75 % water + 1 % 0,1 fosfoorzuur en 25% Acetonitril + 1 % 0,1 fosfoorzuur beter kan beginnen en dan de hoeveelheid acetonitril in stappen te verlagen? Of bij een laag gehalte van Acetonitril beginnen en in stappen het gehalte hiervan te verhogen?

Zitten er zuregroepen in je analiet? Je buffert met fosforzuur dus je buffert heel erg laag. Zijn de OH groepen die je beschrijft van een COOH groep, of is het een phenol achtig iets? Het nadeel van zo laag bufferen is dat je alle andere zuren in je matrix ook in de ongeladen vorm krijgt, waardoor je deze op je kolom zult moeten scheiden. Kun je wat meer vertellen over de matrix en analiet (waaronder dus ook pKa waarden etc).


Het te bepalen component is Echinacoside. De stuctuur van deze stof is te vinden bij de anorganische forumvragen. (Ik kan het niet hierop krijgen).
Het bevindt zich in de wortel van een plant. De kwantiteit echinacoside in de wortel van de plant moet ik dus analyseren. De plantenmatrix is erg complex. Ik weet niet exact waaruit het allemaal bestaat.

Volgens deze literatuur verkregen chromatogram is naast de echinacoside piek de pieken van :
*chlorogensaure(Duitse naam) =benzeen met aan C-atomen 3,4 en 5 alleen een OH-groep en bij C-atoom 1 een OH- en COOH groep.

*Verbacoside= echinacoside i.pv. de bovenste glucose een H-atoom.

*Isochlorogensaure(Duitse naam) = Benzeen met aan C-atoom 1 een OH- en COOH groep. Aan C-atomen 3 en 4 zit een van de koffiezuur afgeleide stuctuur. Dat is de linker zijgroep van de echinacoside structuur alleen zonder de zuurstof die bij echinacoside aan de glukose molecuul vast zit. (3,4-dihydroxypropeenzuur=koffiezuur)
Aan C-atoom 5 zit een OH-groep

Echinacoside zelf heeft geen zure groepen. Het bevat wel twee benzeen ringen met aan ieder benzeenring 2 OH-groepen. Het analiet is polair zal denk ik een hoge pH heeft, Hoeveel het is weet ik niet en kan ik ook niet vinden.

Kan ik de simplex methode gebruiken om de eluens samenstelling voor een goede scheiding te bepalen?
Als het niet zo is, zijn er dan andere methoden die ik kan toepassen?

Groetjes
Jane

Veranderd door Jane, 23 mei 2005 - 14:19


#4

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 mei 2005 - 14:50

Ok je bent maar geinteresseerd in 1 component, dat is mooi. Je hoeft dus alleen Echinacoside van de rest te scheiden. Als ik zou wat zou moeten zeggen zou ik eerst eens een run doen met 25% acetonitriel, en kijken wat je vindt. Daarna zou ik gewoon gaan optimaliseren. Te laag gaan met acetonitriel moet je mee opassen omdat je kolom dan wel eens niet schoon zou kunnen worden. Verder kun je zelf waarschijnlijk beter een schatting kunnen maken voor de juiste concentratie modifier omdat je een chromatogram hebt neem ik aan.

Voor optimalisatie zou ik ZEKER geen simplex methode gebruiken. 3 redenen: 1) in mijn ogen kom je verder met gezond verstand in dit geval dan een "dom" alchoritme laten vertellen wat je nu moet gaan proberen. 2) De simplex methode is niet geavanceerd genoeg voor dit type probleem, er kunnen pieken gaan verschuiven etc waardoor pieken elkaar gaan overlappen en soms weer niet etc. Een simplex bevat geen informatie van een geheel chromatogram! 3) Wat ga je als waarde oordeel geven aan je chromatogram waarop je je simplex baseerd?

Verder zit je wel met een probleem: hoe ga je aantonen dat de piek waarvan jij denkt dat het Echinacoside is identificeren? Heb je een massa spectrometer tot je beschikking?

Wat ik nog als opmerking heb, je bent geinteresseerd in een zuur. De OH groepen aan een benzeenring zijn licht zuur (pKa 10). Wanneer je last blijkt te hebben van een ander zuur met een lagere pH kun je een andere buffer proberen, een waarvan de pKa rond de 8 ligt.

#5

Jane_CF

    Jane_CF


  • >25 berichten
  • 50 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2005 - 05:15

Ik heb geen massapectrometer als detector tot mijn beschikking

Allen een UV detector

#6

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2005 - 09:20

Dan is de methode ontwikkeling erg lastig. Als er componenten in lage concentraties coelueren zie je ze niet. Doe een aantal experimenten met verschillende buffers en modifier sterkte, probeer vervolgens te kijken wat je pieken doen. Hopelijk krijg je dan wat zicht op de zuiverheid van je piek. Verder zeer kritisch kijken naar de vorm wil ook wel eens werken. Verder weet ik niet welke mogelijkheden je hebt in je dataverwerking. Als je de skew kan laten uitrekenen kun je dit ook nog gebruiken

#7

Jane_CF

    Jane_CF


  • >25 berichten
  • 50 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2005 - 14:34

hallo napoleon1981,

Wat is 'de skew'?
Deze term ken ik niet .

#8

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2005 - 15:36

Als je het nulde moment neemt van je piek (piek intergreerd) krijg je de oppervlakte onder de piek. Doe je dit 2x krijg je de average time, 3x dan krijg je de variance, en 4x dan krijg je de skewness (skew) van een piek. Dit wordt ook wel eens het 3e moment genoemd.

Een berekende skew factor van 0 betekend een perfect symetrische piek.
S > 0: tailing peak
S < 0: fronting peak

Wanneer de skew van je piek waarin je geinteresseerd bent verschilt van de skewness van andere pieken, dan kun je er vanuitgaan dat er wat aan de hand is.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures