Springen naar inhoud

primerdesign


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Beko

    Beko


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 oktober 2005 - 15:38

Alvast een heel goede dag, ben nieuw op het forum. Ik studeer moleculair biologie op Hogeschool leiden en zit in de 3de leerjaar.
Ik ben hier terecht gekomen via google. Heb heel wat gelezen, en vind t een goede forum.
-------------------------------------------------------------------------------------------
Ok nu terzake. Wat ik nog niet begrijp is het primerdesign. Je krijgt een stuk sequence, en daar uit moet je je 2 FW-primer2 en BW-primer2 zien uit te halen.
Zo een vraag hadden we op een tentamen gekregen, en kon t niet maken.

Als iemand me kan helpen zou het erg op prijs stellen. Bij vraag 6 zou ik willen weten, hoe je te werk gaat.
--------------------------------------------------------------------------------------------

Onderstaande dubbelstrengs DNA sequentie is een deel van het humane alpha actine gen. Je krijgt de opdracht om 2 sets primers te bestellen voor een standaard PCR reactie. Daarbij houd je de regels voor primer design in het oog. Zorg ervoor dat de primers een stuk van 150 bp amplificeren aan het begin en aan het eind.

1 TCTCCCTGTC CTTGCAGAAA CTAGACACAA TGTGCGACGA AGACGAGACC
AGAGGGACAG GAACGTCTTT GATCTGTGTT ACACGCTGCT TCTGCTCTGG

51 ACCGCCCTCG TGTGCGACAA TGGCTCCGGC CTGGTGAAAG CCGGCTTCGC
TGGCGGGAGC ACACGCTGTT ACCGAGGCCG GACCACTTTC GGCCGAAGCG

101 CGGGGATGAC GCCCCTAGGG CCGTGTTCCC GTCCATCGTG GGCCGCCCCC
GCCCCTACTG CGGGGATCCC GGCACAAGGG CAGGTAGCAC CCGGCGGGGG

151 GACACCAGGT CAGGCTGCCC CTCCGCAGAG GGAGCCGGCT CGGGGTCCCC
CTGTGGTCCA GTCCGACGGG GAGGCGTCTC CCTCGGCCGA GCCCCAGGGG

201 GCGTAAGCCA GCCTGGTGCC ACCCGGAGCG GCGTTAACGG GTGCGTGGTG
CGCATTCGGT CGGACCACGG TGGGCCTCGC CGCAATTGCC CACGCACCAC

251 TCTCGGCTCT GCAGGGCGTC ATGGTCGGTA TGGGTCAGAA AGATTCCTAC
AGAGCCGAGA CGTCCCGCAG TACCAGCCAT ACCCAGTCTT TCTAAGGATG

301 GTGGGCGACG AGGCTCAGAG CAAGAGAGGT ATCCTGACCC TGAAGTACCC
CACCCGCTGC TCCGAGTCTC GTTCTCTCCA TAGGACTGGG ACTTCATGGG

351 TATCGAGCAC GGCATCATCA CCAACTGGGA TGACATGGAG AAGATCTGGC
ATAGCTCGTG CCGTAGTAGT GGTTGACCCT ACTGTACCTC TTCTAGACCG

401 ACCACACCTT CTACAACGAG CTTCGCGTGG CTCCCGAGGA GCACCCCACC
TGGTGTGGAA GATGTTGCTC GAAGCGCACC GAGGGCTCCT CGTGGGGTGG


vraag 6. Geef de sequentie van de primers hieronder weer:

Forward Primer : 5".....................................................3"

Reversed Primer: 5".....................................................3"


Forward Primer : 5".....................................................3"

Reversed Primer: 5".....................................................3"


Vraag 7: Stel, tijdens PCR stoort het apparaat en blijft het o/n op 95° staan in de beginfase. Wat is het gevolg? En wat als dit in de eindfase gebeurt? En wat als halverwege het apparaat op 55°C blijft staan?

Vraag 8: Wat zijn primerdimeren. Hoe voorkom je de vorming hiervan?



Gideon: ik heb hem even verplaatst, moleculaire biologie zie ik meer als het knippen en plakken van DNA ten behoeve van kloneringen

Veranderd door Gideon, 23 oktober 2005 - 18:24

De laatste Christen stierf aan het kruis (Friedrich Nietzsche )

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Gideon

    Gideon


  • Chemiefoum.nl erelid
  • 337 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 oktober 2005 - 18:21

Mh, ok...

Eerst even mijn mening over je tentamenvraag:

Ik vind dat dit echt onzin vragen zijn. Dat je begrijpt hoe PCR werkt en hoe primers gemaakt worden is erg belangrijk. In werkelijkheid is het zo dat er veel meer komt kijken bij primerdesign dan je hier voorgeschoteld krijgt. Niet onbelangrijk zijn de Tm waarden, totaal GC content, kans op dimeren of de temperatuur en bij welke concentratie ze ontstaan. Dit is allemaal met redelijk simpele algoritmes op de PC voor elkaar te krijgen. Dit soort tentamenvragen is naar mijn idee een oversimplificatie van de werkelijkheid en anderzijds moeilijkdoenerij :lol:

Maargoed, even terzake:

Je moet 2 complementaire strengen (sense+antisense) amplificeren, die daarna 1 product vormen waaraan vervolgens nieuwe primers kunnen hybridiseren.
De regel hierbij is dat je forward primer een sequentie die gelijk aan de sense streng is (hij hybridiseert namelijk aan de antisense en is complementair daaraan)
De reverse primer annealt wel aan de sense streng en heeft dus een antisense sequentie (bovendien verandert hierdoor de orientatie van 5' -> 3' en omgekeerd)

Kies dus een amplicon van 150 bp en gebruik de 'standaard regels'. Dit moet je echt zelf opzoeken, maar belangrijk is bijvoorbeeld dat je niet meer dan 3/4 GC in a row etc.
Vraag 6: dit mag je zelf oplossen, zie toelichting hierboven

Vraagje 7: Wanneer in de beginfase het apparaat op 95ºC graden blijft staan, blijven beide strengen gedenatureerd en kan er geen product gevormd worden (primers hybridiseren namelijk niet, enzym wordt gedeactiveerd). Wanneer dit in de eindfase gebeurd er niet veel bijzonders meer, het product is namelijk al gevormd (wellicht is er weinig van je DNA meer over, dus hydrolyse bij hogere temperaturen). Hoewel DNA vrij stabiel is, zou ik het niet eens meer op gel kwakken.

Vraag 8: Primerdimeren, spreekt voor zich.. Er kunnen dus intra- (binnen een primer, alleen van toepassing bij grote strengen), inter (tussen bijv. fw en fw onderling) en tussen fw en rv hybridisaties optreden. Hier moet je dus je primerdesign op aan passen, en evt. een wat lagere primerconcentratie kiezen (dit is vooral belangrijk bij kwantitatieve PCR's met aspecifieke detectie ' Sybr Green methode' )


Hoop dat het duidelijk is

#3

Beko

    Beko


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 oktober 2005 - 20:08

dankjewel voor je reactie. Vraag 7 en 8 zijn wat duidelijker geworden, maar ik zit nog met vraag 6. Ik kom er echt niet uit.
De laatste Christen stierf aan het kruis (Friedrich Nietzsche )





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures