Springen naar inhoud

ELISA


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Thessa

    Thessa


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 november 2005 - 12:27

Ik ben bezig met een eiwitbepaling, dit ga ik doen aan de hand van de ELISA methode. Ik ben er globaal al achter hoe deze werkt, ik vraag me alleen af:

Is het ook mogelijk om hoeveelheden eiwit te bepalen en heb je daar dan een stopreagens of iets dergelijks voor nodig, anders blijft het enzym maar doorgaan neem ik aan.

Verder kan ik niet ontdekken hoe ik de substantie moet wassen elke keer na het toevoegen van een reagens. Doe ik dat gewoon door te centrifugeren?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 10 november 2005 - 13:26

Hallo Tessa,

Ik kan zo geen antwoorden op je vraag geven omdat er te weinig gegevens zijn.
Kun je wat meer van van je bepaling vertellen, gaat het om een specifiek eiwit of totaal eiwit ?
Welk substraat wil je gaan gebruiken en welke substantie wil je wassen?

Gerard

#3

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 november 2005 - 13:44

Thessa,

De meeste commerciele ELISA's zijn kwantitatief, dus hoeveelheden bepalen is dan juist de bedoeling van de assay... je moet dan wel een goede (gevoelige!) reader hebben :)

W.b. wassen: dat is helemaal afhankelijk van het ontwerp van de ELISA, en van de in de assay gebruikte substraten/labels.... om dit te kunnen beantwoorden zal je antwoord moeten geven op Gerard's vragen....

#4

sdekivit

    sdekivit


  • >250 berichten
  • 704 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 november 2005 - 15:48

De ELISA is een kwantitatieve analyse, doordat je kleurintensiteit kunt meten door bijvoorbeeld omzetting van een stofje door HRP (horse radish peroxidase)

Dit is om eiwitten aan te tonen en dan gebruik je PBS om te wassen (en tevens als controle).

#5

Thessa

    Thessa


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 november 2005 - 09:32

Ok dit is wat ik tot nu toe weet van ELISA

Als aan een oplossing van eiwitten een specifiek antilichaam wordt toegevoegd, zal deze gaan reageren met de eiwitten in de oplossing. Hierna wordt de oplossing gewassen om de antilichamen die niet hebben gereageerd te scheiden van het product.
Na deze wassing wordt een anti-antilichaam toegevoegd met hieraan gekoppeld een enzym. Dit anti-antilichaam regeert met het antilichaam wat al gebonden zit aan het eiwit. Het product wordt weer gewassen.
Het enzym heeft de mogelijkheid een bepaalde stof om te zetten in een kleustof. Als deze stof wordt toegvoegd zal het enzym de stof dus omzetten. De kleur die dan ontstaat is dus te meten met een spectrofotometer en aan de hand van een calibratiereeks kan de concentratie bepaald worden.

Alleen wat ik dan dus niet snap is hoe de kleurintensiteit kan verschillen in de verschillende concentraties, want het enzym blijft toch in principe de reagens omzetten totdat deze op is. Of moet je hier met een stopwatch werken en een stopreagens zodat je de enzymactiviteit kunt bepalen.

#6

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 november 2005 - 10:15

Ok Thessa,

Het idee dat je hebt van een ELISA is zo ongeveer wel goed en n de praktijk ziet het er bijvoorbeeld zo uit

Je neemt een drager bijv een 96 wells microtiterplaat of sepharosebolletjes die je coat met een antistof specifiek gericht tegen het eiwit dat je wilt bepalen bijv albumine
vervolgens voeg je het monster toe waarin je albumine wilt bepalen.
na een incubatieperiodewaarin de albumine in je monster gebonden wordt, was je de welletjes met een buffer of de sepharose na afdraaien waardoor al het overige materiaal wordt verwijderd.
Nu voeg je opnieuw aan antistof tegen albumine toe maar dan gekoppeld met een enzymbv fosfatase en incubeer weer eentijdje.
Je wast opnieuw en vervolgens voeg je een substraat toe bv PNPP waardoor zich de kleur onstaat.
Als de kleur voldoende is kun je de reactie stoppen bv met zuur en de extincties aflezen. Deze stap is dus zoals je veronderstelde tijdkritisch en afhankelijk van de periode die nodig is om de kleur te ontwikkelen dit kan lopen van enkel minuten tot uren


Als je weet welk eiwit wilt bepalen kun op het ineternet zoeken of er een firma is die een kit levert om dit eiwit te bepalen en daar het voorschrift downloaden voor specifiekere informatie, mocht dit niet lukken geef dan nog een reactie dan zal ik eens kijken of de informatie kan vinden.

Gerard

Veranderd door Gerard, 11 november 2005 - 10:19


#7

Thessa

    Thessa


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 november 2005 - 15:05

Kijk nu is het me al een stukje duidelijker
Hartstikke bedankt

#8

Dr.Chemo

    Dr.Chemo


  • >100 berichten
  • 131 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 april 2006 - 21:58

vervolgens voeg je het monster toe waarin je albumine wilt bepalen.
na een incubatieperiodewaarin de albumine in je monster gebonden wordt, was je de welletjes met een buffer of de sepharose na afdraaien waardoor al het overige materiaal wordt verwijderd.
Nu voeg je opnieuw aan antistof tegen albumine toe maar dan gekoppeld met een enzymbv fosfatase en incubeer weer eentijdje.


Bij de ELISA kit voor case´ne bijvoorbeeld, voeg je je monster dat case´ne bevat, toe en direct nadien ook case´ne antistoffen. Er zijn namelijk verschillende soorten ELISA's. Zo is de gluten assay kit bijvoorbeeld een sandwhich-methode, terwijl de case´ne kit een competitieve methode is. Case´ne in het monster en de toegevoegde case´ne gaan in competitie. Rusttijd en vervolgens wassen( met wasbuffer). Nadien peroxidase enzym toevoegen, wat enkel met de toegevoegde case´ne reageert. Dan rusttijd en weer wassen. Dan nog substraat ( of chromogeen ) dat reageert met het peroxidase en een laatste keer rusttijd. Om deze reactie te stoppen ordt er dan stop-reagens toegevoegd. Dus bij een kwantitatieve bepaling ( met ijklijn ) zal je hoogste standaard het minst gekleurd zijn. Kleur is dus omgekeerd evenredig met de concentratie.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures