Springen naar inhoud

[chemie] eiwit analyse


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 08 november 2005 - 20:37

Ik wil weten welke 8 bepalingen het beste uit te voeren zijn om een eiwitanalyse uit te voeren. De opdracht zegt niets over de term 'analyse'. Dit kan dus zowel voor een eiwitwitconcentratie gelden (zonder te weten met welk eiwit je te maken hebt) of een bepaling van de een specifiek eiwit. Het uiteindelijke doel is het isoleren van GFP uit een willekeurig eiwitmengsel. Hieruit haal ik dus dat het voornamelijk gaat om een bepaling van de specifieke eiwitten in plaats van het bepalen van de totale concentratie.

De volgende methoden had ik al gevonden.
Lowry

Biureetmethode

Coomassie Brillant Blue

SDS electroforese (PAGE)

Chromatografie:

- gelchromatografie

- vloeistofchromatografie

     o HPLC (High Performance Liquid Chromatography

     o TLC (Thin Layer Chromatography)

     o GPC (Gel Permeation Chromatography)

- Gaschromatografie

Het bepalen welke methode 'de beste' is, dat is iets wat ik zelf zal moeten doen. Deze bepaling zal ik uitvoeren aan de hand van de volgende criteria:
- Waarop berust de methode?

- Wat zijn de onder en de bovengrens van de bepaling?

- Is de methode reproduceerbaar?

- Hoe lang duurt de methode?

Waarop de methode's berusten dat is allemaal vrij eenvoudig in de literatuur te vinden. De onder en de bovengrens daarentegen zijn veel lastiger te vinden. Deze zijn voor een methode zoals 'Lowry' ook nog wel te bepalen. Aangezien je werkt met een fotospectrometer, kan je stellen dat wanneer A :roll: 2, dat de extinctie dan 100% is. Dit kan men dus stellen op de bovengrens. Een echt duidelijke ondergrens zou ik zo niet kunnen bepalen.

Voornamelijk bij de chromatografische bepalingen zit ik nogal met m'n handen in het haar.
"Meep meep meep." Beaker

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Dalton

    Dalton


  • >250 berichten
  • 808 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 09 november 2005 - 15:14

GFP als in Green Fluorescent Protein?

Het uiteindelijke doel is het isoleren van GFP uit een willekeurig eiwitmengsel

In dat geval kun je met verschillende kolommen je eiwit makkelijk zuiveren.

Wat heb je allemaal tot je beschikking?
Probeer je het thuis te zuiveren of heb je een eiwit lab?
Hoe groot is het volume/ concentratie van je eiwit sample?
Wil je gewoon dat eiwit zuiveren of wil je bepalen hoeveel je in een bepaald monster hebt?

Als je een ruim budget hebt en deze bepaling vaker gaat doen is het misschien verstandig om antilichamen tegen GFP te bestellen.
Het is wat duurder maar maakt het wel heel erg makkelijk.
In dat geval: Bind een deel van het antilichaam aan een kolom matrix.
Met deze kolom kun je heel makkelijk GFP zuiveren in vrij hoge zuiverheid. Als je eiwit niet erg "Sticky" is kan je met alleen deze kolom al boven de 99% zuiverheid komen.
Vervolgens kun je met dezelfde antilichamen een halve ELISA doen om de concentratie voor en na kolom te meten en zo de opbrengst te bepalen. Maar als GFP in natieve toestand fluorisceerd heb je geen antilichaam hiervoor nodig maar is een fluorimeter genoeg (soort spectrofotometer maar dan meet het de uitgezonden hoeveelheid licht).

In geval van een kleiner budget wordt het iets lastiger maar is het nog steeds goed te doen.
Dan moet je de eiwitten gaan scheiden op de eigenschappen die je kent, zoals grootte en lading.
Op grootte scheiden is het makkelijkste met een Gelfiltration kolom.
Je brengt je eiwit sample boven aan de kolom. Hoe groter je eiwit hoe eerder die onder de kolom eruit komt (Dit is niet perongeluk omgedraaid zoals je zou verwachten, het is echt groot eerst), Als je de grootte van je eiwit weet, weet je welke fracties je moet bewaren.
Na deze kolom heb je alle eiwitten die ongeveer de grote van GFP hebben.

Vervolgens kun je scheiden op lading met bijvoorbeeld een Q-sepharose kolom. Dan breng je eerst je eiwit op de kolom met een laag zout buffer.
Je eiwit zal aan de kolom blijven plakken vervolgens voeg je steeds iets meer zout toe aan je buffer (gradient) ieder eiwit zal dan bij een andere gradient loslaten en hou je alleen de eiwitten over met dezelfde lading als jou GFP.
Na deze twee kolommen heb je vrij zuiver GFP over, het hangt ervanaf hoe je de kolommen geoptimaliseerd hebt voor de zuiverheid.
Meestal is zuiverheid en opbrengst recht evenredig met elkaar.
Je moet kiezen tussen hoge zuiverheid of een hoge opbrengst.

Zuiverheid bepalen is het makkelijkste en betrouwbaarste met een SDS-PAGE gel.
Opbrengst bepalen kan maar op een paar manieren:
1: Met behulp van antilichamen.
2: Met behulp van specifieke enzymatische activiteit van je eiwit.
3: Met behulp van een unieke eigenschap (Zoals fluorisceren)

#3

sdekivit

    sdekivit


  • >250 berichten
  • 704 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 10 november 2005 - 17:57

om je eiwit te zuiveren kun je ook gebruik maken van affiniteitschromatografie of een ionenwisselaar en 2D electroforese :roll:

#4

Wouter_Masselink

    Wouter_Masselink


  • >5k berichten
  • 8246 berichten
  • VIP

Geplaatst op 10 november 2005 - 18:24

Dank jullie allemaal voor de tips. Voordat we dit uit moeten voeren duurt het nog een paar weken. Ik heb dus nog wat tijd.
"Meep meep meep." Beaker





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures