Springen naar inhoud

Transfectie controle


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 januari 2006 - 12:31

Hallo allemaal,
Ik ben met mijn project bezig met het transfecteren van een plasmide (pSG8) met een insert (oppervlakte antigeen) in Cos-1 cellen (aap-nier).
De controle doe ik met behulp van Elisa. Indien de Elisa test geen resultaat geeft kan dit door twee problemen komen:
- De plasmide is niet getransfecteerd
- Het oppervlakte antigeen komt niet ter expressie

Welke techniek kan ik het beste gebruiken om te controleren of de plasmide goed is geplaatst?
Zelf dacht ik aan pcr, maar ik denk dat er ook wel een makkelijkere en snellere techniek is om dit aan te tonen....

Veranderd door Roy van Heesbeen, 15 januari 2006 - 12:32


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 15 januari 2006 - 14:33

Heeft het plasmide geen celspecieke eigenschap?
Zo kun je bijvoorbeeld een stukje gen in plaatsen dat een specifieke eigenschap heeft waardoor je deze cellen kan onderscheiden van de andere cellen. Dat de cel een specifiek eiwit aanmaakt waarop je de cellen kunt kleuren.
Kun je misschien ook wat meer vertellen over het plasmide pSG8?

MvG Ron

#3

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 januari 2006 - 19:10

Op de plasmide (pSG8MP) zitten de volgende genen, ik heb van de meeste een beetje kunnen uitzoeken wat ze inhouden:
Ik begin van bp 1
- SV40 / SV40 ori : voor een hogere expressie van de insert (HBsAg)
- Beta globine intron
- MCS: plek voor de insert
- PRE : post-transcriptional regulation element (dit ken ik niet)
- SV40 poly
- Puromicine resistentie gen
- pUC ori
- Ampicilline resestentie gen
- f1 ori

Ik heb een plaatje van de vector op mn pc, maar ik kan hem op internet niet vinden, ik hoop dat je er zo wat meer mee kan...
De vector wordt in cos cellen geplaatst omdat deze het antigeen op de juiste manier kunnen vouwen.

#4

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 16 januari 2006 - 16:45

ik deed altijd transfectie met behulp van bacteriŽn. Dat wil zeggen dat ik deze plasmide in een bacterie bracht en dat ik ze dan specifiek ga uitplaten op platen met Ampicilline en Puromicine. Alleen de bacteriŽn met die specifieke plasmide blijft dan leven waardoor je dan een schatting kunt maken hoeveel procent transfectie je hebt. Maar nu vraag ik mij af of je zo iets ook kunt doen met COS-1 cellen. :P

Ik weet zo niet of er een gen bij zit die een specifiek eiwit aanmaakt waardoor je met behulp van ELISA deze zichtbaar kunt maken.
Misschien een idee voor je uitwendige antigen. Ik dacht aan een selectief antilichaam en deze fluorescerend maken.

MvG Ron

#5

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 16 januari 2006 - 16:57

Hmja, de Elisa was negatief, dus het kan zijn dat het eiwit niet goed is gevouwd in het golgisysteem.
Cos cellen zijn dierlijke cellen, en deze zijn dus ongevoelig voor antibiotica.
De heb de vector vermenigvuldigd in E.coli, daarvoor heb ik de resistentiegenen wel gebruikt.
Maar ik weet dus niet precies of de vector goed is geplaatst. Meestal wordt dit gecontroleerd met het enzym Luciferase (vuurvliegen) of via galactosidase, maar volgens mij maken de overige genen deze enzymen niet.

#6

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 21 januari 2006 - 14:15

Ik zou niet weten hoe je deze dan moet herkennen zonder het aan te kunnen tonen met deze specifieke enzymen.
Misschien moet je nog een stukje in de plasmide plaatsen.

MvG Ron

#7

witte_CF

    witte_CF


  • >25 berichten
  • 40 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 21 januari 2006 - 16:39

Het was toevallig geen cotransfectie?

Maar dat is misschien een wat te simpele oplossing

#8

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 22 januari 2006 - 19:04

Ik ben wel heel benieuwd hoe je het hebt opgelost. Dus laat even een berichtje achter als je eruit bent.

MvG Ron

#9

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 januari 2006 - 12:40

Na overleg met mijn opdrachtgever van BioMerieux blijkt dus dat de vector geen controle heeft voor de transfectie. :)
Er zit dus alleen een controle in voor de transfectie in E.coli cellen (amp gen).
Mijn opdrachtgever gaat er 100% van uit dat het eiwit tot expressie komt als de transfectie gelukt is. Als er dus geen resultaat uitkomt bij de Elisa test betekend dit dus dat of de test fout is, of dat de transfectie is mislukt.

#10

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 30 januari 2006 - 16:40

Beetje jammer natuurlijk want als het niet goed gaat weet je niet precies wat er nou loos is. Geplaatste afbeelding

Maar goed het uiteindelijke doel is toch dat er een eiwit tot expressie moeten worden gebracht en als dat werkt is het ook prima toch :)

MvG Ron





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures