Hallo allemaal,
Ik ben met mijn project bezig met het transfecteren van een plasmide (pSG8) met een insert (oppervlakte antigeen) in Cos-1 cellen (aap-nier).
De controle doe ik met behulp van Elisa. Indien de Elisa test geen resultaat geeft kan dit door twee problemen komen:
- De plasmide is niet getransfecteerd
- Het oppervlakte antigeen komt niet ter expressie
Welke techniek kan ik het beste gebruiken om te controleren of de plasmide goed is geplaatst?
Zelf dacht ik aan pcr, maar ik denk dat er ook wel een makkelijkere en snellere techniek is om dit aan te tonen....
Laatste berichten
-
14:55
wig
-
14:55
Herleiden afmetingen vanaf een foto 20
-
13:57
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 9
-
13:16
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 17
-
13:12
[natuurkunde] kroon van koning op Syracuse 10
-
12:01
Gravity and gravitation 1
-
10:15
2013 – Augustus Vraag 3 3
-
09:54
Bruine vlekken op treinaanwijzerbord 6
-
23:07
Rood laserlicht 2
-
15:28
Vraag 2009 Juli Vraag 5 5
-
24 apr
positie 2
-
24 apr
Schroefdraad berekening 8
-
24 apr
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
23 apr
Weerfrustratie 9
-
23 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 3
-
23 apr
De Euro Nederlandse 100 qubit computer komt eraan
-
23 apr
projectiel 8
-
23 apr
Verschil tussen deze 2 vragen 5
-
23 apr
[scheikunde] berekeningen labo vitamine c bepaling 1
-
22 apr
[wiskunde] rode en witte ballen verdelen 8
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
Transfectie controle
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 2.330
Re: Transfectie controle
Heeft het plasmide geen celspecieke eigenschap?
Zo kun je bijvoorbeeld een stukje gen in plaatsen dat een specifieke eigenschap heeft waardoor je deze cellen kan onderscheiden van de andere cellen. Dat de cel een specifiek eiwit aanmaakt waarop je de cellen kunt kleuren.
Kun je misschien ook wat meer vertellen over het plasmide pSG8?
MvG Ron
Zo kun je bijvoorbeeld een stukje gen in plaatsen dat een specifieke eigenschap heeft waardoor je deze cellen kan onderscheiden van de andere cellen. Dat de cel een specifiek eiwit aanmaakt waarop je de cellen kunt kleuren.
Kun je misschien ook wat meer vertellen over het plasmide pSG8?
MvG Ron
-
- Berichten: 740
Re: Transfectie controle
Op de plasmide (pSG8MP) zitten de volgende genen, ik heb van de meeste een beetje kunnen uitzoeken wat ze inhouden:
Ik begin van bp 1
- SV40 / SV40 ori : voor een hogere expressie van de insert (HBsAg)
- Beta globine intron
- MCS: plek voor de insert
- PRE : post-transcriptional regulation element (dit ken ik niet)
- SV40 poly
- Puromicine resistentie gen
- pUC ori
- Ampicilline resestentie gen
- f1 ori
Ik heb een plaatje van de vector op mn pc, maar ik kan hem op internet niet vinden, ik hoop dat je er zo wat meer mee kan...
De vector wordt in cos cellen geplaatst omdat deze het antigeen op de juiste manier kunnen vouwen.
Ik begin van bp 1
- SV40 / SV40 ori : voor een hogere expressie van de insert (HBsAg)
- Beta globine intron
- MCS: plek voor de insert
- PRE : post-transcriptional regulation element (dit ken ik niet)
- SV40 poly
- Puromicine resistentie gen
- pUC ori
- Ampicilline resestentie gen
- f1 ori
Ik heb een plaatje van de vector op mn pc, maar ik kan hem op internet niet vinden, ik hoop dat je er zo wat meer mee kan...
De vector wordt in cos cellen geplaatst omdat deze het antigeen op de juiste manier kunnen vouwen.
-
- Berichten: 2.330
Re: Transfectie controle
ik deed altijd transfectie met behulp van bacteriën. Dat wil zeggen dat ik deze plasmide in een bacterie bracht en dat ik ze dan specifiek ga uitplaten op platen met Ampicilline en Puromicine. Alleen de bacteriën met die specifieke plasmide blijft dan leven waardoor je dan een schatting kunt maken hoeveel procent transfectie je hebt. Maar nu vraag ik mij af of je zo iets ook kunt doen met COS-1 cellen. 
Ik weet zo niet of er een gen bij zit die een specifiek eiwit aanmaakt waardoor je met behulp van ELISA deze zichtbaar kunt maken.
Misschien een idee voor je uitwendige antigen. Ik dacht aan een selectief antilichaam en deze fluorescerend maken.
MvG Ron
Ik weet zo niet of er een gen bij zit die een specifiek eiwit aanmaakt waardoor je met behulp van ELISA deze zichtbaar kunt maken.
Misschien een idee voor je uitwendige antigen. Ik dacht aan een selectief antilichaam en deze fluorescerend maken.
MvG Ron
-
- Berichten: 740
Re: Transfectie controle
Hmja, de Elisa was negatief, dus het kan zijn dat het eiwit niet goed is gevouwd in het golgisysteem.
Cos cellen zijn dierlijke cellen, en deze zijn dus ongevoelig voor antibiotica.
De heb de vector vermenigvuldigd in E.coli, daarvoor heb ik de resistentiegenen wel gebruikt.
Maar ik weet dus niet precies of de vector goed is geplaatst. Meestal wordt dit gecontroleerd met het enzym Luciferase (vuurvliegen) of via galactosidase, maar volgens mij maken de overige genen deze enzymen niet.
Cos cellen zijn dierlijke cellen, en deze zijn dus ongevoelig voor antibiotica.
De heb de vector vermenigvuldigd in E.coli, daarvoor heb ik de resistentiegenen wel gebruikt.
Maar ik weet dus niet precies of de vector goed is geplaatst. Meestal wordt dit gecontroleerd met het enzym Luciferase (vuurvliegen) of via galactosidase, maar volgens mij maken de overige genen deze enzymen niet.
-
- Berichten: 2.330
Re: Transfectie controle
Ik zou niet weten hoe je deze dan moet herkennen zonder het aan te kunnen tonen met deze specifieke enzymen.
Misschien moet je nog een stukje in de plasmide plaatsen.
MvG Ron
Misschien moet je nog een stukje in de plasmide plaatsen.
MvG Ron
-
- Berichten: 40
Re: Transfectie controle
Het was toevallig geen cotransfectie?
Maar dat is misschien een wat te simpele oplossing
Maar dat is misschien een wat te simpele oplossing
-
- Berichten: 2.330
Re: Transfectie controle
Ik ben wel heel benieuwd hoe je het hebt opgelost. Dus laat even een berichtje achter als je eruit bent.
MvG Ron
MvG Ron
-
- Berichten: 740
Re: Transfectie controle
Na overleg met mijn opdrachtgever van BioMerieux blijkt dus dat de vector geen controle heeft voor de transfectie. 
Er zit dus alleen een controle in voor de transfectie in E.coli cellen (amp gen).
Mijn opdrachtgever gaat er 100% van uit dat het eiwit tot expressie komt als de transfectie gelukt is. Als er dus geen resultaat uitkomt bij de Elisa test betekend dit dus dat of de test fout is, of dat de transfectie is mislukt.
Er zit dus alleen een controle in voor de transfectie in E.coli cellen (amp gen).
Mijn opdrachtgever gaat er 100% van uit dat het eiwit tot expressie komt als de transfectie gelukt is. Als er dus geen resultaat uitkomt bij de Elisa test betekend dit dus dat of de test fout is, of dat de transfectie is mislukt.
-
- Berichten: 2.330
Re: Transfectie controle
Beetje jammer natuurlijk want als het niet goed gaat weet je niet precies wat er nou loos is. 
Maar goed het uiteindelijke doel is toch dat er een eiwit tot expressie moeten worden gebracht en als dat werkt is het ook prima toch
MvG Ron
Maar goed het uiteindelijke doel is toch dat er een eiwit tot expressie moeten worden gebracht en als dat werkt is het ook prima toch
MvG Ron
