Hi,
Voor een project moet ik E.coli lyseren om zo het eiwit amidase eruit te krijgen. Nu weet ik dat dit kan met sonificatie en lysozym. Omdat sonificatie door een ander projectgroep is gebruikt wil ik het graag proberen met lysozym.
Weet iemand waar ik hiervoor een voorschrift kan vinden ofzo, zodat ik weet hoeveel lysozym ik moet toevoegen. Ik kweek met ongeveer 2 liter LB medium (in een fermentor).
Alvast thnx!
Laatste berichten
-
23:12
speciale rel. theorie 10
-
22:57
Straatklok loopt 5 minuten voor 11
-
22:57
wig 6
-
22:36
Gravity and gravitation 4
-
22:24
[scheikunde] vraag Chemie - wat is de oplossing? 10
-
19:47
Bruine vlekken op treinaanwijzerbord 10
-
19:44
Vogels in de stad zijn goede klussers 2
-
19:12
Rood laserlicht 3
-
17:30
Herleiden afmetingen vanaf een foto 21
-
16:34
[wiskunde] Prijs Product per KG; Alternatief Inzicht 3
-
13:57
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 9
-
13:16
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 17
-
13:12
[natuurkunde] kroon van koning op Syracuse 10
-
10:15
2013 – Augustus Vraag 3 3
-
24 apr
Vraag 2009 Juli Vraag 5 5
-
24 apr
positie 2
-
24 apr
Schroefdraad berekening 8
-
24 apr
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
23 apr
Weerfrustratie 9
-
23 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 3
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
Openbreken E.coli
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 740
Re: Openbreken E.coli
Ik heb het een keer gedaan met de kookmethode, dit was eigelijk bedoeld voor de plasmide isolatie, maar dit kan je ook gebruiken voor een bepaling voor eiwitten. Ik weet alleen niet meer hoeveel lysozym ik toe had gevoegd, dat moet ik dan even opzoeken. De methode gaat als volgt:
1. 1,5ml E.coli cultuur (overnacht): 2 min centrifugeren
2. Pellet oplossen en lysozym toevoegen
3. 40 sec. in een kokend waterbad
4. 5 min. centrifugeren (waterlaag bevat de eiwitten, plasmiden en andere macromoleculen).
In mijn labjouraal staat 60 mg lysozym voor 2 ml cultuur, maar ik weet niet zeker of ik dat ook gebruikt had...
1. 1,5ml E.coli cultuur (overnacht): 2 min centrifugeren
2. Pellet oplossen en lysozym toevoegen
3. 40 sec. in een kokend waterbad
4. 5 min. centrifugeren (waterlaag bevat de eiwitten, plasmiden en andere macromoleculen).
In mijn labjouraal staat 60 mg lysozym voor 2 ml cultuur, maar ik weet niet zeker of ik dat ook gebruikt had...
-
- Berichten: 740
Re: Openbreken E.coli
Je hebt trouwens ook nog andere methoden, zoals de alkalische lysismethode en de phenol behandeling. Er zijn ook nog andere methoden zoals met SDS.
-
- Berichten: 125
Re: Openbreken E.coli
De kook methode klinkt leuk en aardig, maar als het gaat om een amidase (een enzym) te isoleren en eventueel een aktiviteit vast te stellen, zou ik het koken maar achterwege laten. De meeste eiwitten denatureren bij verhitting.
Sjouke
Sjouke
-
- Berichten: 740
Re: Openbreken E.coli
klopt idd, maar het is maar voor 40 seconden. De alkalische lysismethode is denk ik het meest geschikt, maar daar kan het eiwit ook door worden aangetast (NaOH en SDS).
-
- Berichten: 2.035
Re: Openbreken E.coli
Veel info over het lyseren van e. coli (inclusief reactievoorschrift) vind je hier!
-
- Berichten: 6
Re: Openbreken E.coli
Allemaal super bedankt voor jullie reacties!
Maar als ik het allemaal zo bekijk vallen de alkalische methode en mbv lysozym al af, omdat 40 sec koken te lang is en toevoegen van SDS ook niet ideaal is, omdat het zo zijn natieve conformatie verliest.
Maar ik ga maar eens de link die herminator heeft geplaatst goed uitpluizen, volgens mij kom ik er dan wel uit!
Maar als ik het allemaal zo bekijk vallen de alkalische methode en mbv lysozym al af, omdat 40 sec koken te lang is en toevoegen van SDS ook niet ideaal is, omdat het zo zijn natieve conformatie verliest.
Maar ik ga maar eens de link die herminator heeft geplaatst goed uitpluizen, volgens mij kom ik er dan wel uit!
-
- Berichten: 9
Re: Openbreken E.coli
Hoi !
Misschien ben ik een beetje laat met mijn reactie, maar ik heb nog een protocol betreffende het lyseren van E.Coli. De lysis is t.b.v. plasmide isolatie, dus niet onder de meest gunstige omstandigheden voor eiwitisolatie, maar misschien is n-butanol dan een goed alternatief.
1. Resuspendeer, na afcentrifugeren, het pellet in 100 microliter TGE met lysozym. (Hierbij is 1,5 ml overnachtculture afgecentrifugeerd).
TGE: 25 mM Tris HCL (pH 8,0), 50 mM glucose, 10 mM EDTA (voor gebruik 1:1 verdunnen en daarna 2mg/ml lysozym toevoegen)
2. Eventueel 5 min incuberen op ijs
3. Deze stap staat niet beschreven. Voeg toe: n-butanol (als het goed is lost zo het plasmamembraan op
)
Normaal gesproken wordt het plasmamembraan met SDS gelyseerd, maar t.b.v. eiwitisolatie kan, volgens mij, beter n-butanol gebruikt worden.
Eventuele verbeteringen hoor ik wel van m'n mede forumleden
Ik hoop dat je er wat aan hebt. Groetjes Chrisis
Misschien ben ik een beetje laat met mijn reactie, maar ik heb nog een protocol betreffende het lyseren van E.Coli. De lysis is t.b.v. plasmide isolatie, dus niet onder de meest gunstige omstandigheden voor eiwitisolatie, maar misschien is n-butanol dan een goed alternatief.
1. Resuspendeer, na afcentrifugeren, het pellet in 100 microliter TGE met lysozym. (Hierbij is 1,5 ml overnachtculture afgecentrifugeerd).
TGE: 25 mM Tris HCL (pH 8,0), 50 mM glucose, 10 mM EDTA (voor gebruik 1:1 verdunnen en daarna 2mg/ml lysozym toevoegen)
2. Eventueel 5 min incuberen op ijs
3. Deze stap staat niet beschreven. Voeg toe: n-butanol (als het goed is lost zo het plasmamembraan op
)Normaal gesproken wordt het plasmamembraan met SDS gelyseerd, maar t.b.v. eiwitisolatie kan, volgens mij, beter n-butanol gebruikt worden.
Eventuele verbeteringen hoor ik wel van m'n mede forumleden
Ik hoop dat je er wat aan hebt. Groetjes Chrisis
