Springen naar inhoud

Chloroform-extractie tijdens DNA isolatie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 februari 2006 - 11:29

Kan iemand mij vertellen waarom je na het toevoeging van chloroform aan een DNA (+ andere troep, o.a. RNA en eiwitten) oplossing, de oplossing niet mag vortexen, maar rustig moet mengen?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 februari 2006 - 12:59

Vortexen (al is het een beetje afhankelijk van het apparaat) introduceert lokaal heel veel warmte in je mengsel, dus ik denk dat het daarmee te maken heeft: het zou dus het dna kunnen denatureren, of het chloroform beginnen te verdampen....

Het kan natuurlijk ook simpelweg zijn om de "dna-slierten" in je oplossing niet te fragmenteren....

Er loopt hier op het forum vast wel iemand rond die er meer verstand van heeft :)

#3

Raspoetin

    Raspoetin


  • >1k berichten
  • 3514 berichten
  • VIP

Geplaatst op 07 februari 2006 - 13:08

Vortexen (al is het een beetje afhankelijk van het apparaat) introduceert lokaal heel veel warmte in je mengsel, dus ik denk dat het daarmee te maken heeft: het zou dus het dna kunnen denatureren, of het chloroform beginnen te verdampen....

Dit lijkt me onzin (no offence Herminator) maar heel veel warmte lijkt me ook wel wat overdreven. Het meest irritante is dat ik het wel een keer heb gehoord, maar ik ben het vergeten. Het had iets met de eiwitten te maken geloof ik, die dan gingen uitvlokken.

Edit: Hetzelfde als de kok die eiwitten opklopt. Door heftig te schudden denatureert het eiwit en vormt lange ketens (of zoiets). Deze zijn moeilijk uit je oplossing te krijgen. Eventuele opmerkingen van personen die er ťcht iets van af weten om mijn verhaal af te schieten zijn welkom :) /edit

Veranderd door Raspoetin, 07 februari 2006 - 13:12

I'm not suffering from insanity - I'm enjoying every minute of it!!

#4

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 februari 2006 - 14:17

Ik zei al: het hangt van het apparaat af.... of heb ik nu het verkeerde soort Vortex in gedachten? :P Ik dacht aan zo'n heavy-duty staafmixer (ook wel Turrax geheten)....

Die denaturatie klinkt inderdaad aannemelijk (er begint me zelfs iets te dagen over een eerdere discussie hier op het forum over eiwit kloppen?!?), maar er moet hier wel ergens een echte eiwit-specialist rondhangen..... we wachten wel even!

En geen zorgen: ik neem niet zo makkelijk offence (moet dat niet offense zijn? :)) aan nuttige kritiek!

edit: dikke vingers :P

Veranderd door The Herminator, 07 februari 2006 - 14:20


#5

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 februari 2006 - 15:31

Denaturatie van de eiwitten door flink vortexen klinkt inderdaad heel aannemelijk. Maar is dat zo'n probleem in het geval van een DNA isolatie? Dan is het toch niet erg wanneer je eiwitten denatureren? Uiteindelijk wil je toch alleen je DNA hebben?

Maar misschien kan de moleculair bioloog dat verklaren.

edit: ik lees net in een ander draadje, dat vortexen vermeden moet worden om het DNA niet te breken.

Sjouke

Veranderd door Hovinsj1, 07 februari 2006 - 15:40


#6

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 07 februari 2006 - 16:51

Toevoeging:
chloroform verdampt echt heel snel en als je het dan ook nog een snel gaat vortexen ben je zo je hoeveelheid chloroform kwijt.
DNA moet inprincipe wel tegen een stootje kunnen denk ik aangezien je bij het lyseren van cellen ook gebruik maakt van een vortex. Maar als ze rechtstreeks uit de 4 graden gekomen (bak ijs) dan worden ze denk ik niet zo heel snel warm.

MvG Ron

#7

Raspoetin

    Raspoetin


  • >1k berichten
  • 3514 berichten
  • VIP

Geplaatst op 07 februari 2006 - 17:14

Even info voor Herminator: Een Vortex is een apparaat waarom aan de bovenkant een houder excentrisch draait. De doet hier de onderkant van de reageerbuis in, drukt licht en de houder gaat dan excentrische cirkeltjes beschrijven. De onderkant van de reageerbuis ook, en de bovenkant (waar je hem vast hebt), niet. Gevolg: De inhoud van de RB gaat snel ronddraaien en je oplossing wordt geroerd.

Plaatje van een vortex in actie
I'm not suffering from insanity - I'm enjoying every minute of it!!

#8

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 februari 2006 - 20:46

Ok bedankt.... toch wat anders dan een Turrax dus! :)

#9

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 februari 2006 - 08:54

Denaturatie van de eiwitten door flink vortexen klinkt inderdaad heel aannemelijk. Maar is dat zo'n probleem in het geval van een DNA isolatie? Dan is het toch niet erg wanneer je eiwitten denatureren? Uiteindelijk wil je toch alleen je DNA hebben?

Maar misschien kan de moleculair bioloog dat verklaren.

edit: ik lees net in een ander draadje, dat vortexen vermeden moet worden om het DNA niet te breken.

Sjouke

Okay, dat wilde ik ff weten, daar heb ik namelijk last van

#10

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 16 maart 2006 - 13:06

Okay, ik weet nu wat chloroform doet met DNA wanneer er gevortext wordt (het kan dus kapot gaan, waardoor ik netto minder DNA overhoudt).
Gebeurt bij een 2-butanol-extractie hetzelfde toevallig?

#11

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 16 maart 2006 - 15:27

Aangezien het niet specifiek de combinatie van chloroform en "mechanisch roeren" zal zijn die de schade doet, maar uitsluitend het (heftige) roeren zelf, denk ik dat er in 2-butanol precies hetzelfde gebeurt! :lol:

#12

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 17 maart 2006 - 08:14

Aangezien het niet specifiek de combinatie van chloroform en "mechanisch roeren" zal zijn die de schade doet, maar uitsluitend het (heftige) roeren zelf, denk ik dat er in 2-butanol precies hetzelfde gebeurt! :lol:

Kijk, dan kan ik dat weer eens tijdens DAT protocol uitvoeren (als je ziet dat ik er +- 95% van me DNA mee verlies is alles het proberen waard ;)

#13

The Herminator

    The Herminator


  • >1k berichten
  • 2035 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 17 maart 2006 - 10:41

Succes! :lol:

#14

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 20 maart 2006 - 14:35

Helaas, heeft niet geholpen; ik ga nu me pijlen denk maar richten op me ethanol-precipitatie.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures