Springen naar inhoud

Plasmideisolatie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 februari 2006 - 19:49

Hoi allemaal,

Ik zit met een probleem, op school ben ik bezig met een transfectie, hiervoor moet ik eerst een plasmide uit E.coli isoleren.

Ik gebruik hiervoor de endofree Qiagen Maxi plasmid isolation kit.
Bij een van de stappen (neerslaan van de plasmide) moet ik centrifugeren op 15000 x g op 4 0 celcius voor 30 minuten.

Op school hebben wij hiervoor een centrifuge van Beckman, maar deze is momenteel buiten gebruik.
Ik kan nu alleen gebruik maken van een centrifuge die max. 3300 x g kan en die niet temperatuur instelbaar is.

Weet iemand of het ook een mogelijkheid is om deze centrifuge te gebruiken, en zo ja, hoelang moet ik deze instellen? Of kan ik dat beter niet doen?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 14 februari 2006 - 20:41

Ik denk dat je een probleem hebt. Die snelheid heb je nodig om het plasmide tegen de bodem te krijgen voor een goede scheiding. Die pasmide is niet super gevoelig voor temperatuur, zoals RNA maar hij is niet goed dat hij en lang moet draaien en niet bij 4 graden blijft. Ik kan je nu al zeggen dat het je waarschijnlijk niet gaat lukken. Dus je hebt echt een ultra centrifuge nodig.

MvG Ron

#3

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 februari 2006 - 21:51

Tja dat dacht ik ook al, ik merkte al dat de plasmiden niet meer neerslaan bij een hogere temperatuur. Ik had ipv 30 minuten al 60 geprobeerd en tussendoor een paar minuten laten afkoelen op ijs. Ik zag toen ook al snel dat er nog maar weinig DNA was neergeslagen..

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 februari 2006 - 21:55

Weet je eventueel nog andere manieren om de plasmide te isoleren? Ik moet een hoge opbrengst hebben, en zoveel mogelijk endotoxine vrij...

#5

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 14 februari 2006 - 22:50

Nee eerlijk gezegd niet je hebt echt een centrifuge nodig anders kun je de moleculair biologische materiaal niet van elkaar scheiden. Voor moleculaire methodes heb je echt een goede centrifuge nodig. Maar misschien weet iemand anders nog iets.

MvG Ron

#6

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 februari 2006 - 23:01

ok toch bedankt, ik zal dan iets anders moeten verzinnen...

#7

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 21 februari 2006 - 12:04

Je zei dat je een kit gebruikte; mijn ervaring met kits is dat ze niet een erg hoge opbrengst opleveren.
Kun je niet beter zelf een isolatie-protocol oid opstellen (ik zal in me pauze ff zoeken nog voor je, ik heb zelf ook plasmides geisoleerd op school, zonder 4 graden nodig te hebben.)
Zoek eens in pubmed.com naar artikelen die hierover gepubliceerd zijn.

#8

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 22 februari 2006 - 11:05

Je zei dat je een kit gebruikte; mijn ervaring met kits is dat ze niet een erg hoge opbrengst opleveren.
Kun je niet beter zelf een isolatie-protocol oid opstellen (ik zal in me pauze ff zoeken nog voor je, ik heb zelf ook plasmides geisoleerd op school, zonder 4 graden nodig te hebben.)
Zoek eens in pubmed.com naar artikelen die hierover gepubliceerd zijn.

Ok, duurde ff; ik heb hiervoor me een protocol van 3 blz. lang; zal proberen zo kort mogelijk te houden:

1. Van een o/n gegroeide vloeibare cultuur wordt 1,5 ml. in een epje gedaan (wij gebruiken Eppendorf). Draai dit 1 minuut af in een (Eppendorf) centrifuge; giet het supernatant af en haal het laatste restje weg met een pipet; pellet moet zo droog mogelijk zijn).
2. Het pellet wordt geresuspendeerd in 100 μl TEG/lysozym toe door op en neer te pipetteren.
3. Laat het 5 minuten bij kamertemp. staan
4. Voeg 200 μl NaOH/SDS oplossing toe (deze moet vers gemaakt zijn!). Mix door de tube om en om te keren (niet vortexen!). Zet het epje 5 minuten op ijs.
5. Voeg 150 μl koude KOAc toe. Mix en zet 5 minuten op ijs.
6. Centrifugeer 5 minuten bij 4C (dit deden wij dus gewoon bij kamertemp., omdat het al op ijs had gestaan).
7. Doe het supernatant over in een schoon epje.
8. Voeg 50 μl phenol/chloroform toe en vortex goed. Centrifugeer 2 minuten en breng de bovenste fase over in een schoon epje.
9. Voeg 50 μl chloroform/isoamylalcohol toe. Mix goed. Centrigufeer 2 minuten en breng de bovenste fase over in een schoon epje.
10. Voeg 900 μl ijskoude 96% EtOH toe. Mix door het epje om en om te keren en laat het 5 minuten bij kamertemp. staan
11. Centrifugeer 5 minuten.
12. Verwijder het supernatant zo compleet mogelijk!
13. Voeg 1 ml ijskoude 70% EtOH toe. Mix door het epje om en om te keren en centrifugeer 5 minuten.
14. Verwijder ook nu weer het supernatant zo compleet mogelijk
15. Droog het pellet 5 minuten bij 56C in een heatblock.
16. Los het pellet op in 50 μl TE (pH 8.0) welke DNase-vrije RNase bevat (20 μg/ml).
17. Je kunt het DNA nu opslaan bij -20C of gelijk doorgaan met een volgend exp. hiermee.

Je kunt nu ff kijken of dit protocol enigszins overkomt met het protocol dat jij gebruikt; wil je het complete protocol moet je me ff een mailtje sturen:

hierstondeenemailadres@hierstondeenprovider.nl


Beryllium: emailadres ge-edit.

Veranderd door Beryllium, 13 maart 2006 - 09:41


#9

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 12 maart 2006 - 21:55

Ja ik heb zulke protocollen ook al uitgevoerd, het probleem alleen is dat ik de plasmide gebruik voor transfectie. De cellen (COS, african green monkey) die ik gebruik zijn zeer gevoellig voor endo-toxinen.
Met deze protcollen blijven deze toxinen vaak nog in hoge concentraties achter bij het lyseren van de cel met SDS.
Daarom gebruik ik de endofree kit van Qiagen, waarin endotoxine removal buffers zitten.

#10

Raspoetin

    Raspoetin


  • >1k berichten
  • 3514 berichten
  • VIP

Geplaatst op 13 maart 2006 - 09:38

(...)
hierstondeenemailadres@hierstondeenprovider.nl

Een e-mail adres!!! :lol:
Kun je beter niet doen hoor Astridje85. Er zijn speciale stukjes software geschreven die fora afstruinen op zoek naar email adressen, om zo spam te versturen. Ik zou hem maar even weghalen als ik jou was, of een moderator lief aankijken of die het voor jou wilt doen.


Beryllium: dank voor de tip, ik had het niet gezien... je hebt helemaal gelijk, dus ik heb hem maar aangepast ;)

Veranderd door Beryllium, 13 maart 2006 - 09:42

I'm not suffering from insanity - I'm enjoying every minute of it!!

#11

bluefox

    bluefox


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 maart 2006 - 17:33

Die endotoxinen moet je toch kwijt kunnen raken met een aantal fenol/chloroform zuiveringstappen
of met een protease behandeling
of door een normale scheiding op agar

Groet
Rob





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures