Springen naar inhoud

DNA bij 100°C


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 februari 2006 - 14:29

Tijdens mijn isolatie-procedure heb ik een stap waarbij ik mijn DNA-pellet na mijn ethanol-precipitatie droog 1 minuut bij 100°C; voorheen werd het pellet 15 minuten gedroogd in een vacuumcentrifuge.
Nu heb ik rare dingen op mijn gel, en vraag mij af of dit komt doordat deze stap vervangen is.

Kan het dus kwaad om je DNA pellet 1 minuut te drogen bij 100°C?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Raspoetin

    Raspoetin


  • >1k berichten
  • 3514 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 februari 2006 - 14:50

Door zijn bijzonder grote lengte in vergelijking met ander belangrijke celcomponenten zoals enzymen is het DNA-molecuul erg stralingsgevoelig d.w.z. heeft een grote trefkans. Het molecuul betstaat gewoonlijk uit twee primaire ketens die zodanig om elkaar zijn gewonden dat ze een dubbele spiraal (zg. Helix) vormen. De ketens zijn door zwakke waterstofbruggen met elkaar verbonden. Door verhitting tot een temperatuur van 50 - 100 °C worden deze bruggen verbroken, waardoor de ruimtelijke structuur verloren gaat. Dit leidt tot denaturatie van het DNA en daarmee tot inactivatie van de cel.


http://www.fooddata....=91&TopicID=200

Misschien een verklaring? Maar aan de andere kant:

De twee strengen, waaruit een DNA molecuul is opgebouwd, kunnen van elkaar worden gescheiden. Dit kan door een alkalibehandeling (pH groter dan 11) of door ze te verhitten (100°C). Door deze behandeling worden de waterstofbruggen tussen de basen verbroken.
Dit proces, waarbij een oplossing van enkelstrengs DNA ontstaat, wordt smelten of denatureren genoemd.
Als men deze oplossing langzaam laat afkoelen (65°C) of de pH verlaagt dan treedt er spontaan herstel op. De twee strengen vormen samen weer een dubbelstrengs DNA. Dit proces noemt men hybridisatie.


http://web.hasdb.nl/.../5_bio_ger.html


Misschien te snel afgekoeld? Maar er zijn mensen op het forum die er veeeel meer vanaf weten dan ik, dus wacht ik daar maar even op.
I'm not suffering from insanity - I'm enjoying every minute of it!!

#3

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 februari 2006 - 18:10

Is dit een voorschrift van een isolatie Kit?
Wordt het DNA gebruikt voor realtime PCR?
Ik maakte gebruik van een vacuumcentrifuge bij een temperatuur van volgens mij 65 graden maar goed dat was RNA en geen DNA.

MVG Ron

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 februari 2006 - 21:47

Ik doe het nooit verhitten, nadat ik alle ethanol heb afgepipetteerd, droog ik het met een vacuumpomp voor 10 į 15 minuten.
Was het pellet nog wit na het drogen, of kleurloos?

#5

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 februari 2006 - 09:17

Is dit een voorschrift van een isolatie Kit?
Wordt het DNA gebruikt voor realtime PCR?
Ik maakte gebruik van een vacuumcentrifuge bij een temperatuur van volgens mij 65 graden maar goed dat was RNA en geen DNA.

MVG Ron

Niet van een kit, uit een artikel (Chen, W., Kuo, T., A simple and rapid method for the preparation of Gram-negative bacterial genomic DNA , Nucleic Acids Research, 1993, 21, p. 2260), met modificaties van onze afdeling (o.a. dus die 100°C)
DNA wordt niet gebruikt voor een realtime PCR, maar voor een DNA-DNA hybridisatie in microtiterplaten.
We hebben wel een vacuum-vac, maar vanwege tijdswinst kozen we voor de 100°C

#6

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 februari 2006 - 09:19

Ik doe het nooit verhitten, nadat ik alle ethanol heb afgepipetteerd, droog ik het met een vacuumpomp voor 10 į 15 minuten.
Was het pellet nog wit na het drogen, of kleurloos?

Dat deed ik dus in het begin ook, maar vanwege de tijdswinst ( 1 minuut bij 100°C)
hebben we hiervoor gekozen.
Het pellet is 9 van de 10 keer kleurloos.

#7

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 februari 2006 - 11:54

Ik heb de helft van mijn monsters behandeld met de vacuumcentrifuge en de andere helft 1 minuut bij 100 °C.

Het mocht helaas niet baten.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures