DS DNA denatureren

Astridje85_CF

Ik weet bij dat je bij temperaturen boven de 90°C DNA kan denatureren.

Maar hoelang moet je het verhitten? En ik neem aan dat je het daarna op ijs moet zetten opdat het niet renatureert.

bteunissen

Hoe lang je het op hoge temperatuur moet houden weet ik niet. Maar ik kan je wel vertellen dat na denaturatie de temperatuur weer omlaag kan want denaturatie is een onomkeerbaar proces! Je verbreekt namelijk de tertiaire/quarternaire structuur en als deze eenmaal verbroken is dan hersteld dze niet meer. Dus op ijs houden is niet nodig.

Bas

Astridje85_CF

bteunissen schreef: Hoe lang je het op hoge temperatuur moet houden weet ik niet. Maar ik kan je wel vertellen dat na denaturatie de temperatuur weer omlaag kan want denaturatie is een onomkeerbaar proces! Je verbreekt namelijk de tertiaire/quarternaire structuur en als deze eenmaal verbroken is dan hersteld dze niet meer. Dus op ijs houden is niet nodig.

Bas

Okay, ik had begrepen dat als je de DNA-oplossing langzaam laat afkoelen dat het weer renatureert

Raspoetin

Okay, ik had begrepen dat als je de DNA-oplossing langzaam laat afkoelen dat het weer renatureert

Klopt:

De twee strengen, waaruit een DNA molecuul is opgebouwd, kunnen van elkaar worden gescheiden. Dit kan door een alkalibehandeling (pH groter dan 11) of door ze te verhitten (100°C). Door deze behandeling worden de waterstofbruggen tussen de basen verbroken.

Dit proces, waarbij een oplossing van enkelstrengs DNA ontstaat, wordt smelten of denatureren genoemd.

Als men deze oplossing langzaam laat afkoelen (65°C) of de pH verlaagt dan treedt er spontaan herstel op. De twee strengen vormen samen weer een dubbelstrengs DNA. Dit proces noemt men hybridisatie.

http://web.hasdb.nl/DienstenVoorBedrijven/.../5_bio_ger.html

Zie ook http://www.chemieforum.nl/forum/index.php?showtopic=5741

bteunissen

Hmm, ik zal wat voorzichtiger moeten zijn met het plaatsen van mijn stellingen....

Wat ik niet begrijp bij de renaturatie is hoe de strengen elkaar weer vinden en alle basen volledig aan elkaar koppelen tot de oorspronkelijke basen paren? Kan ik concluderen dat een renaturatie niet in de buurt komt van 100% herstel?

Bas

Raspoetin

Ik heb geleerd dat dat gewoon spontaan gebeurt. De waterstofbruggen herstellen zich weer, en ssDNA wordt weer dsDNA. En weer een lap tekst:

Het ontwinden en scheiden van DNA strengen, (...) Als de thermische energie stijgt, breekt de resulterende verhoging in moleculaire beweging eventueel de waterstofbruggen en andere krachten die de dubbele helix stabiliseren; de strengen scheiden dan, uiteengedreven door de elektrostatische repulsie van de negatief geladen deoxyribose-fosfaat ruggegraat van elke streng.

(...)

De enkelstrengige DNA moleculen die resulteren van de denaturatie vormen willekeurige windingen zonder georganiseerde structuur. De temperatuur verlagend, de ionenconcentratie verhogend of de pH neutraliserend doet de twee complementaire strengen terug associëren in een perfecte dubbele helix. De mate van zulke renaturatie hangt af van tijd, DNA concentratie en ionenconcentratie. Twee niet in sequentie verwante DNA strengen zullen als willekeurige windingen blijven en niet renatureren; het belangrijkste: ze zullen complementair DNA partner strengen niet remmen in het vinden van elkaar en in hun renaturatie. Denaturatie en renaturatie van DNA liggen aan de basis van nucleïnezuur hybridisatie, een krachtige techniek gebruikt voor de studie van de verwantschap tussen twee DNA stalen en het opsporen en isoleren van specifieke DNA moleculen in een mengsel dat vele verschillende DNA moleculen bevat.

En voor de vakidioten:

De smeltingstemperatuur aan de DNA strengen zullen scheiden hangt af van verschillende factoren. Moleculen die een grotere portie G-C paren bevatten, vereisen hogere temperaturen voor te denatureren door de drie waterstofbruggen die deze baseparen stabieler maken dan de A-T paren, die slechts twee waterstofbruggen hebben. Het percentage van G-C basen in een DNA staal kan inderdaad geschat worden van zijn Tm. De ion concentratie beïnvloedt ook de Tm doordat de negatief geladen fosfaat groepen in de twee strengen dan afschermd worden door positief geladen ionen. Wanneer de ionconcentratie laag is, vermindert deze afscherming, dus verhogen de repulsieve krachten tussen de strengen en verlaagt de Tm. Reagentia die waterstofbruggen destabiliseren, zoals formaide of ureum, verlagen ook de Tm. Tenslotte denatureert DNA bij extreme pH-waarden aan lage temperaturen. Bij lage (zure) pH worden de basen geprotoneerd en dus positief geladen, elkaar afstotend. Bij hoge (basische) pH verliezen de basen protonen en worden negatief geladen, elkaar weer afstotend door een gelijkaardige lading.

http://1ebacharts.medica.be/files/celbiolo...e%EFnezure1.doc

Kortom, om een definitef antwoord te geven aan de vragensteller: Snel afkoelen, dan krijgt het ssDNA geen kans op de renatureren. Echter, voor hoe lang de strengen uit elkaar blijven weet ik niet.

biochemiefreak

Dit zelfs doe je natuurlijk ook met een PCR. Dan haal je de ds DNa uitelkaar door te verhitten zodat de primers zijn werk kunnen doen.

MvG Ron

Roy van Heesbeen

1 minuut is al genoeg

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

DS DNA denatureren

DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren

Re: DS DNA denatureren