Springen naar inhoud

Ionen en agarose gel-elektroforese


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 maart 2006 - 11:57

Kun je zout-ionen op een agarose gel zien?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 13 maart 2006 - 12:01

Ik begrijp de vraag niet, waarom zou je zout-ionen op een agarosegel willen zien en in welke context?

#3

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 maart 2006 - 12:04

Ik begrijp de vraag niet, waarom zou je zout-ionen op een agarosegel willen zien en in welke context?

Ik neem een vreemd bandje waar op mijn agarose gel ter hoogte van 100 bp (weet niet hoeveel Daltons dit is); ik heb van alles geprobeerd, het is geen RNA, het is geen DNA, het zou nog eiwit kunnen zijn; maar nu kwam ik net op internet tegen dat je zout-ionen meeprecipiteren bij je DNA isolatie; dus ik vroeg me af of je ze daarna dan op gel kan zien.

Dit is de link btw:

http://wwwimp.leiden...20PRECIPITATION

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 maart 2006 - 19:35

Als je goed zuiverd blijven er geen zouten meer over, welke zuivering heb je gebruikt?

Als er een soort van sluier onderaan de laan voorkomt is dit vaak een vervuiling van RNA en eiwitten. Zouten kunnen niet gezien worden omdat hier een gewone DNA kleuring niet aan hecht, aan RNA en eiwitten is dit wel het geval (wel veel minder sterk als aan dsDNA).

Veranderd door Roy van Heesbeen, 13 maart 2006 - 19:37


#5

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 maart 2006 - 08:16

Als je goed zuiverd blijven er geen zouten meer over, welke zuivering heb je gebruikt?

Als er een soort van sluier onderaan de laan voorkomt is dit vaak een vervuiling van RNA en eiwitten. Zouten kunnen niet gezien worden omdat hier een gewone DNA kleuring niet aan hecht, aan RNA en eiwitten is dit wel het geval (wel veel minder sterk als aan dsDNA).

Das dus het vreemde; het onderste bandje (waarvan ik niet weet wat het is) is dus veel sterker gekleurd dan het bandje waarvan ik zeker ben dat het DNA is.
Verder is het volgens mij te klein om RNA te kunnen zijn (minder dan 100 bp); en eiwitten ben ik nog naar aan het kijken, ook al is het niet aannemelijk (zie verder).

Mijn isolatie-protocol in het kort:

Na lysis van de bacterie-cellen met lysisbuffer doe ik er NaCl bij; dit laat ik een half uur afdraaien en bij het supernatant doe ik chloroform, dit laat ik 3 minuten afdraaien en daarna begin ik met de ethanol-precipitatie.
Nu lijkt het mij dat je bij de chloroform-extractie de zouten (dus ook de ionen) weghaalt uit de oplossing, maar als er dus een aantal overblijven dan kunnen deze tijdens de ethanol-precipitatie meeprecipiteren met het DNA (althans dat stond in de link).
Maar dan rest de vraag dus of die ionen met EtBr aangekleurd kunnen worden!?

Tijdens de lysisstap heb ik ook een RNase stap ingebouwd; ik ben er dus vrij zeker van dat er geen RNA meer aanwezig is. Om dit bevestigen heb ik na de chloroformstap nogmaals een RNase stap ingebouwd, maar ook dit verhielp het 2de bandje op mijn gel niet.
Eiwit is misschien een optie, maar daarvoor zijn de zuiverheden van mijn oplossingen te hoog voor (de 260/280 ratio ligt rond de 2.0; als je eiwit meehebt daalt het naar onder de 1.7).

#6

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 maart 2006 - 15:18

Tja dat is wel vreemd, ik zou zo dan ook niet kunnen zeggen wat het zou kunnen zijn. De laatste mogelijkheid is dan DNA resten, zoals bijvoorbeeld primerdimers als je een niet-geoptimaliseerde PCR uitvoerd.
In ieder geval als ik zoiets zie zou ik wel denken dat het RNA resten zijn, maar jij hebt RNase gebruikt dus in principe is dit niet mogelijk, maar het kan natuurlijk altijd dat er kleine stukjes RNA achterblijven.

Ionen worden niet gekleurd door EtBr.

Veranderd door Roy van Heesbeen, 14 maart 2006 - 15:20


#7

Astridje85_CF

    Astridje85_CF


  • >25 berichten
  • 67 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 maart 2006 - 16:42

Tja dat is wel vreemd, ik zou zo dan ook niet kunnen zeggen wat het zou kunnen zijn. De laatste mogelijkheid is dan DNA resten, zoals bijvoorbeeld primerdimers als je een niet-geoptimaliseerde PCR uitvoerd.
In ieder geval als ik zoiets zie zou ik wel denken dat het RNA resten zijn, maar jij hebt RNase gebruikt dus in principe is dit niet mogelijk, maar het kan natuurlijk altijd dat er kleine stukjes RNA achterblijven.

Ionen worden niet gekleurd door EtBr.

Ik doe niet aan PCR, dus primer dimeren kunnen het niet zijn.
Verder is het niet echt een duidelijk bandje, en zeer klein (minder dan 100 bp).
Nu zei een collega tegen me, dat als je zulke kleine fragmenten als een 'keurig'bandje op je gel wil zien, dat je dan een dikkere %-gel moet gebruiken (ik gebruik nu een 1% gel). Dus ik denk dat ik daar nog ff mee aan de slag gaat.

#8

Biotechje

    Biotechje


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 10 maart 2007 - 11:45

Tja dat is wel vreemd, ik zou zo dan ook niet kunnen zeggen wat het zou kunnen zijn. De laatste mogelijkheid is dan DNA resten, zoals bijvoorbeeld primerdimers als je een niet-geoptimaliseerde PCR uitvoerd.
In ieder geval als ik zoiets zie zou ik wel denken dat het RNA resten zijn, maar jij hebt RNase gebruikt dus in principe is dit niet mogelijk, maar het kan natuurlijk altijd dat er kleine stukjes RNA achterblijven.

Ionen worden niet gekleurd door EtBr.

Ik doe niet aan PCR, dus primer dimeren kunnen het niet zijn.
Verder is het niet echt een duidelijk bandje, en zeer klein (minder dan 100 bp).
Nu zei een collega tegen me, dat als je zulke kleine fragmenten als een 'keurig'bandje op je gel wil zien, dat je dan een dikkere %-gel moet gebruiken (ik gebruik nu een 1% gel). Dus ik denk dat ik daar nog ff mee aan de slag gaat.

Misschien een buiten de kwestie vraag... :oops:
wat houdt precies een ethanol precipitatie in? op wat is dat gebaseerd?
In ons labo doen we deze precipitatie om dna sequentiestalen op te zuiveren. Maar waarom precies ethanol?
Ik vermoed dat de DNA strengen in deze context zullen neerslaan en de mono en oligonucleotiden niet.
Is dat door de mol. massa van ethanol mss?

alvast bedankt! Geplaatste afbeelding





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures