Met HPLC meet ik de concentratie van stof X in gal en feces van ratten bij 430 nm. Hiervoor gebruik ik als eluens chloroform met 1% MeOH en 0,5 % azijnzuur. Nu heb ik bij een paar samples twee extra pieken die overlap hebben met de piek van stof X die ik wil meten (bijna dezelfde retentietijd).
Hoe krijg ik een betere scheiding tussen de pieken (Maw hoe trek ik ze verder uit elkaar?).
-verlagen flowrate?
-MeOH omhoog of omlaag in eluens?
-Azijnzuur omhoog of omlaag in eluens?
Alvast bedankt!
Laatste berichten
-
23:25
2013 – Augustus Vraag 3
-
23:07
Rood laserlicht 2
-
23:04
Bruine vlekken op treinaanwijzerbord 5
-
15:28
Vraag 2009 Juli Vraag 5 5
-
12:51
positie 2
-
10:44
Schroefdraad berekening 8
-
24 apr
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
23 apr
Weerfrustratie 9
-
23 apr
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 15
-
23 apr
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 7
-
23 apr
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 3
-
23 apr
De Euro Nederlandse 100 qubit computer komt eraan
-
23 apr
projectiel 8
-
23 apr
Verschil tussen deze 2 vragen 5
-
23 apr
[scheikunde] berekeningen labo vitamine c bepaling 1
-
22 apr
[wiskunde] rode en witte ballen verdelen 8
-
22 apr
Rotatie van het heelal 41
-
22 apr
Muntje opgooien 14
-
21 apr
Reactiviteit silyl enol ethers 1
-
21 apr
Criterium voor vochtretentie
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
overlapping pieken reversed HPLC apolair
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 1.122
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Hallo.
Begrijp ik het goed dat je een eluens gebruikt die volledig uit chloroform, azijnzuur en methanol bestaat? Dus geen water?
Dan: zo 1,2,3 vertellen hoe je je scheiding kunt optimaliseren gaat helaas niet. (was het maar zo makkelijk!).
Als je pieken nét niet basislijn gescheiden zijn dan zou je je flowrate iets omhoog kunnen stellen. Dit kan lijden tot scherpere pieken. De azijnzuurconcentratie aanpassen zal denk ik geen gunstige invloed hebben. waarvoor diend het zuur in jouw scheiding?
Als je er met een isocratische scheiding niet uit komt dan zou je het kunnen proberen met een gradiënt. Dan wordt het veel proberen om er een juiste gradiënt uit te krijgen om je pieken te scheiden...
Bas
edit: kun je nog wat meer vertellen over je scheiding? Dus over je kolom je te scheiden moleculen etc...
Begrijp ik het goed dat je een eluens gebruikt die volledig uit chloroform, azijnzuur en methanol bestaat? Dus geen water?
Dan: zo 1,2,3 vertellen hoe je je scheiding kunt optimaliseren gaat helaas niet. (was het maar zo makkelijk!).
Als je pieken nét niet basislijn gescheiden zijn dan zou je je flowrate iets omhoog kunnen stellen. Dit kan lijden tot scherpere pieken. De azijnzuurconcentratie aanpassen zal denk ik geen gunstige invloed hebben. waarvoor diend het zuur in jouw scheiding?
Als je er met een isocratische scheiding niet uit komt dan zou je het kunnen proberen met een gradiënt. Dan wordt het veel proberen om er een juiste gradiënt uit te krijgen om je pieken te scheiden...
Bas
edit: kun je nog wat meer vertellen over je scheiding? Dus over je kolom je te scheiden moleculen etc...
-
- Berichten: 3.507
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
ALs ze bijna dezelfde retenteitijd hebben hebben ze nagenoeg dezelfde affiniteit met de stationaire fase en mobiele fase. Ik verwacht dat het veranderen van je methanol en/of azijnzuur niet heel veel zal uithalen, maar aan de andere kant is 1% methanol niet veel en zou het kunnen zijn dat een verhoging naar 2% (of zelfs 5%) grote invloed kan hebben.
Maar misschien ben je vrij om een andere kolom te nemen?
Ik zie nu de post van Bas; en inderdaad zoals ik het lees: geen water. Daar heb ik overheen gelezen en ik moet zeggen dat ik vrijwel geen ervaring heb met een watervrije mobiele fase.
Maar misschien ben je vrij om een andere kolom te nemen?
Ik zie nu de post van Bas; en inderdaad zoals ik het lees: geen water. Daar heb ik overheen gelezen en ik moet zeggen dat ik vrijwel geen ervaring heb met een watervrije mobiele fase.
I'm not suffering from insanity - I'm enjoying every minute of it!!
-
- Berichten: 238
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
ja en waarom zou je niet een klein beetje (1-5%) water toevoegen?
Azijnzuur kan: waarop wil je je pH hebben? pH kan van grote invloed zijn: wat meet je? zwak zuren stoffen/componenten?
ook kan je flow te hoog staan of misschien kun je de kolomoven temperatuur iets opschroeven?
Azijnzuur kan: waarop wil je je pH hebben? pH kan van grote invloed zijn: wat meet je? zwak zuren stoffen/componenten?
ook kan je flow te hoog staan of misschien kun je de kolomoven temperatuur iets opschroeven?
-
- Berichten: 2.399
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Je kunt hier niets zinnigs over zeggen wanneer je niet weet welke stoffen dit zijn.
-
- Berichten: 3
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Hallo, ten eerste hartelijk bedankt voor jullie reacties. Even nog wat achtergrond. De stof die ik meet is bilirubine, een zwak zuur. Normaal gesproken meet ik dit in de feces van proefdieren (labratten), met behulp van een interne standaard (xantobilirubine). Nu wil het geval dat als deze beestjes op dieet X staan, dit dieet zelf zorgt voor de intefererende pieken; dit is toeval aangezien er geen bilirubine in het dieet kan zitten. Maw: ik wil de bilirubinepiek scheiden van twee pieken van onbekende stoffen met vrijwel dezelfde retentietijd, gemeten bij 430 nm. Mijn kolom is een lichosorb 5160 5um (VDS optilab, montabaur, Duitsland).
-
- Berichten: 238
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
zwak zuur dus pH heeft invloed (meer of minder affiniteit met eluens)
kun je je monster niet wat opzuiveren?
@napoleon:
ook al weet je niet welke stofjes gemeten moeten worden, kun je toch een boel dingen noemen die de resolutie kunnen verbeteren, omdat ze altijd opgaan voor HPLC.
Een eluens (RPLC) met meer water trekt pieken uit elkaar, lagere flow trekt chromatogram uit elkaar, pH eluens is bij zwak zure of baische componenten een factor.
@ franscuperus:
alle opties die je noemt
Misschien iets om er toch een beetje water bij te doen??!!!
edit=schrijffoutje
kun je je monster niet wat opzuiveren?
@napoleon:
ook al weet je niet welke stofjes gemeten moeten worden, kun je toch een boel dingen noemen die de resolutie kunnen verbeteren, omdat ze altijd opgaan voor HPLC.
Een eluens (RPLC) met meer water trekt pieken uit elkaar, lagere flow trekt chromatogram uit elkaar, pH eluens is bij zwak zure of baische componenten een factor.
@ franscuperus:
alle opties die je noemt
kun je zelf uitproberen door dit gewoon te doen: pH omlaag (meer HAc, meer MeOH, etc) Zo zie je zelf het effect.
-verlagen flowrate?
-MeOH omhoog of omlaag in eluens?
-Azijnzuur omhoog of omlaag in eluens?
Misschien iets om er toch een beetje water bij te doen??!!!
edit=schrijffoutje
-
- Berichten: 1.122
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Flow aanpassen zal hier denk ik toch geen gunstige invloed hebben. Je hebt sterk overlappende pieken. Als je de flow omlaag doet dan zal je aan de ene kant iets meer gescheiden pieken hebben maar de piekverbreding als gevolg van de lagere flow speelt ook sterk mee. Dus je resolutie zal er denk ik niet op vooruit gaan in dit geval.jb31dec schreef:ook al weet je niet welke stofjes gemeten moeten worden, kun je toch een boel dingen noemen die de resolutie kunnen verbeteren, omdat ze altijd opgaan voor HPLC.
Een eluens (RPLC) met meer water trekt pieken uit elkaar, lagere flow trekt chromatogram uit elkaar.
Over het eluens: ik blijf het toch erg raar vinden; RP-HPLC met een eluens zónder water.... ik wilde zeggen 'onmogelijk', ware het niet dat franscuperus het zelf doet...Misschien iets om er toch een beetje water bij te doen??!!!
Bas
-
- Berichten: 2.399
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Ik mag er toch vanuit gaan dat het analiet op zijn minst een K` waarde heeft van 5, meer water in de mobiele fase doet dan weinig tot niets meer (zeker niet als de pieken coeluteren). Het is de selectiveitsfactor van de kolom die dan tekort schiet, een langere scheiding komt alleen de piekverbreeding ten goede.jb31dec schreef: @napoleon:[/b]
ook al weet je niet welke stofjes gemeten moeten worden, kun je toch een boel dingen noemen die de resolutie kunnen verbeteren, omdat ze altijd opgaan voor HPLC.
Een eluens (RPLC) met meer water trekt pieken uit elkaar, lagere flow trekt chromatogram uit elkaar, pH eluens is bij zwak zure of baische componenten een factor.
Punt2 pH kun je niks zinnigs over zeggen als je niet weet wat je interferenten zijn.
De flowrate, er is maar 1 optimale flowrate voor een HPLC kolom, kijk maar eens naar de van deemter vegelijking. Sneller gaan zie ik nog de voordelen van in (highthroughput), maar onder de aanbevolen flowrate heb je alleen maar verlies.
Ik heb het idee dat je interferent chemisch gezien ontzettend lijkt op je analiet, je met bij 430 nanometer, dit is niet het gebied waarin een gemiddelde stof goed absorbeert.
Je kunt wat in het wilde weg gissen met pH, maar het heeft weinig meer met wetenschappelijk te werk gaan temaken. Je kunt de bekende chromatografie driehoek proberen (wat THF bijvoorbeeld), maar het blijft nu allemaal gissen. Method development op een UV systeem is bijzonder moeilijk.
-
- Berichten: 2.399
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Dit was ik nog vergeten te zeggen. Water en chloroform dat gaat niet lukken. Probeer deze vloeistoffen maar eens te mengenjb31dec schreef: Misschien iets om er toch een beetje water bij te doen??!!!
edit=schrijffoutje
-
- Berichten: 1.122
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Super idee toch?! On-line Liquid-Liquid-Extractie!
-
- Berichten: 1.153
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
been there, done that....Super idee toch?! On-line Liquid-Liquid-Extractie!
-
- Berichten: 278
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Probeer langere kolom, en iets met temperatuur...
-
- Berichten: 1.122
Re: overlapping pieken reversed HPLC apolair
Ik denk dat `franscuperus´ zo 2 maanden later zijn probleem toch wel opgelost zal hebben...... 
