Springen naar inhoud

HPLC werking


  • Log in om te kunnen reageren

#1

wesley_CF

    wesley_CF


  • 0 - 25 berichten
  • 1 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 juni 2006 - 12:03

wat houd de HPLC in?
wat is de werking van een HPLC?

of de principie van een HPLC?

het enige wat ik erover weet
Hogedrukvloeistofchromatografie, beter bekend onder de Engelse afkorting HPLC (High Performance Liquid Chromatography; let op: niet High Pressure!) is een scheidingsmethode, het is vloeistofchromatografie waarbij de mobiele fase onder hoge druk door een sterk gepakte kolom wordt geperst. Door de hoge druk en het goede contact met de stationaire fase wordt een relatief grote snelheid bereikt van de scheiding, en een zeer goede resolutie.


ik moet namelijk een soort presentatie houden over de HPLC..
-werking
- principe

en zou wel wat hulp kunnen gebruiken
alvast bedankt

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Fuzzwood

    Fuzzwood


  • >5k berichten
  • 11101 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 14 juni 2006 - 13:03

Nou in de kolom zit een apolaire stationaire fase en de mobiele fase is polair. Er zal uiteindelijk een evenwicht optreden tussen de SF en MF, waardoor een scheiding optreedt, aangezien de ene stof liever in de MF zit en de andere in de SF.

#3

JeroenCV

    JeroenCV


  • >1k berichten
  • 1153 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 juni 2006 - 15:58

Zoek eens het boek van Braam, met de titel chromatografie.

Trouwens verder op dit forum (en internet) staat het een en ander goed uitgelegd. Zoek met goede termen en je kan van alles vinden.

#4

Cubefreak

    Cubefreak


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 september 2006 - 18:49

In de informatie die je hebt staat "(let op: NIET High Pressure)"
Maar de afkorting HPLC wordt minstens net zo vaak vertaald met High Pressure Liquid Chromatography. En niet door mensen die het bij het verkeerde eind hebben, maar gewoon door specialisten uit het vakgebied zelf.

Maar deze vorm van chromatografie komt erop neer dat je een mobiele fase hebt (in de regel een mengsel van een waterige vloeistof en een organische vloeistof (denk aan gewoon water gemengd met methanol)). Vaak wordt er ook een hulpstof toegevoegd, welke stof of stoffen dat is/zijn hangt af van het te analyseren monster.

Deze mobiele fase wordt zo genoemd omdat deze beweegt, een HPLC bevat een pomp die ervoor zorgt dat je mobiele fase door je kolom heengeperst wordt en hierna langs een detector komt.
Ergens op de HPLC zit een injector, hierin kun je met een spuit je monster injecteren, vervolgens wordt je monster door de druk die op de mobiele fase staat meegevoerd door je systeem en als eerste de kolom naderen.

In deze kolom zit de stationaire fase. Je hebt ontzettend veel verschillende kolommen (lange/korte, dikke/dunne, glazen/metalen, enz.). Maar het grote verschil zit hem toch vaak in de pakking. De kolom is namelijk gevuld met zeer fijne korreltjes.

Wanneer je monster door de kolom heen komt zullen de verschillende stoffen van elkaar gescheiden worden omdat de ene stof liever in de mobiele fase, de andere stof lost weer goed op in de stationaire fase.
Stoffen die goed in de stationaire fase oplossen zullen er langer over doen voor ze uit de kolom komen dan stoffen die niet of nauwelijks in deze stationaire fase oplossen. Dat is ook logisch, de stationaire fase staat immers stil dus een stof die goed oplost in deze fase zal tijdelijk stil komen te staan terwijl de stoffen die opgelost zijn in de mobiele fase gewoon doorstromen.

Het gevolg hiervan is dus dat stoffen die goed oplosbaar zijn in de mobiele fase weinig tijd doorbrengen in de stationaire fase en dus snel de kolom gepasseerd zijn, terwijl stoffen die goed oplossen in de stationaire fase pas veel later van de kolom af komen omdat ze zich een groot deel van de tijd niet voortbewogen hebben door de kolom. Er ontstaat dus een scheiding.

Omdat de stoffen gescheiden zijn passeren ze om de beurt de detector. De detector is heel vaak een UV-VIS detector. Wanneer er een stof voorbij komt de anders is dan de mobiele fase zal de detector een signaal op vangen en zul je op je papier/computer een piek zien verschijnen.

Aan de hand van de tijden die de stoffen erover gedaan hebben om bij de detector te komen kun je uitspraken doen over welke stoffen in je monster zitten.

#5

Cubefreak

    Cubefreak


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 september 2006 - 19:07

Een praktisch voorbeeld hierbij.

Je wil bijvoorbeeld kijken of er in vanillevla vanilline zit. (Vanilline is het hoofdbestanddeel van natuurlijke vanille, maar natuurlijke vanille bevat veel meer stoffen dan alleen vanilline)
Maar goed, om het even niet te moeilijk te maken gaan we alleen kijken over er vanilline in die vla zit.

Wat je dan in de praktijk doet:

Je weegt een bepaalde hoeveelheid vanilline af, en verdund deze totdat je een verdunning hebt die goed gedetecteerd kan worden (vaak ligt het meetgebied waarin je goed kunt meten op zeer lage concentraties; denk aan milligrammen/liter)
Van deze stof weet je dat het vanilline is (je hebt deze gewoon besteld bij een leverancier) en die injecteer je.

Onder de omstandigheden waarin je werkt zie je na 7 minuten een piek op je papier verschijnen.
Dat is je eerste gegeven, je weet dat vanilline er 7 minuten over doet om door de kolom te komen.

Nu ga je je vla oplossen, je oplossing filtreren en extraheren. Soms zijn nog andere voorbewerkingen nodig maar daar gaat het nu niet om.
Je injecteerd het monster vervolgens, op je blaadje verschijnen een aantal pieken:
een na 3 minuten
een na 3,7 minuten
een na 6 minuten
een na 7 minuten
en een na 12,2 minuten (mooie randomgetallen)

Je ziet op 7 minuten een piek verschijnen... precies hetzelfde als wat je zag toen je gewone vanilline had geinjecteerd... hoihoi we hebben bewezen dat er vanilline in vanillevla zit...
Daar komt het ongeveer op neer... er zijn echter nog veel praktische problemen waar je tegenaan kunt lopen.

*) Sowieso kun je alleen maar zeggen dat er waarschijnlijk vanilline in je monster (de vla) zat, dit is niet met zekerheid vast te stellen omdat er meer stoffen bestaan die er zo lang over zullen doen, of anders in ieder geval nagenoeg even lang waardoor je dus verkeerde conclusies trekt
*) Je monstervoorbewerking kan mis zijn gegaan, er zijn bijvoorbeeld alsnog stoffen in je monster die er eigenlijk uit hadden moeten gaan tijdens het filtreren
*) Je vraagt je af of er vanilline in die vla zit, maar je hebt geen enkel idee in wat voor concentratie het in die vla zit, dus je weet niet hoe vaak je je vla moet verdunnen om in het meetbare gebied van je detector te werken
*) Verder kan het zijn dat je monster temperatuurgevoelig is of afbreekt wanneer je het in het licht laat staan
*) Een andere mogelijk probleem kan je HPLC-systeem zelf zijn, de pomp kan bijvoorbeeld stuk zijn waardoor hij geen regelmatige druk kan leveren, je detector kan kapot gaan, of je kolom kan verstopt raken

Zo zijn er nog genoeg redenen te bedenken waarom alleen een analyse met een HPLC systeem toch nog onbetrouwbaar kan zijn, hoewel het opzich een hele interessante en goede methode is (meer de 3/4 van alle analyses worden gedaan op een HPLC (of UPLC, wat hetzelfde is, alleen kan een UPLC een hogere druk weerstaan, een HPLC gaat bij een te hoge druk gewoon kapot, je drukt dan je kolom ineen waardoor je kolomlengte steeds veranderd... bovendien zijn kolommen niet goedkoop))

Ik hoop dat je (of iemand anders) iets met deze informatie kunt doen

#6

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 06 september 2006 - 07:56

Zo zijn er nog genoeg redenen te bedenken waarom alleen een analyse met een HPLC systeem toch nog onbetrouwbaar kan zijn, hoewel het opzich een hele interessante en goede methode is (meer de 3/4 van alle analyses worden gedaan op een HPLC (of UPLC, wat hetzelfde is, alleen kan een UPLC een hogere druk weerstaan, een HPLC gaat bij een te hoge druk gewoon kapot, je drukt dan je kolom ineen waardoor je kolomlengte steeds veranderd... bovendien zijn kolommen niet goedkoop))

Hier ben ik het niet meer mee eens.

1) Het aantal analyses dat met de HPLC gedaan wordt is lager dan 3/4. Het hangt heel erg af van het type bedrijf. In de petrochemische industrie maakt men meestal gebruik van GC en in de farmaceutische industrie van HPLCs. Buiten deze scheidings-methoden zijn er nog zat andere methoden om analyses te verrichten.
2) Een UPLC is niet speciaal omdat het hoge drukken kan weerstaan, maar omdat het hoge drukken kan leveren. Uiteraard moet een UPLC deze druk dan ook kunnen weerstaan, anders heb je er niks aan.
3)Een HPLC gaat niet stuk bij een hoge druk, de pomp kan gewoon niet meer aan en vliegt in de beveiliging. Voor een UPLC geldt trouwens het zelfde, alleen de kritische druk ligt 10x zo hoog.
4) Een kolom wordt niet kapot gedrukt hoor bij een hoge druk. Kolommen worden gepakt met een druk die vele malen hoger is dan een normale HPLC kan leveren, dit om het silica bed zo te zetten dat het niet ingedrukt kan worden. Vraag je maar eens af waar een hoge druk vandaan komt..... Dit komt door verstoppingen etc. Dus je kolom is op het moment dat de druk omhoog gaat gewoon niet meer de oude. Kolom lengte is dus een constante en geen variabele!

Veranderd door Napoleon1981, 06 september 2006 - 08:32


#7

bteunissen

    bteunissen


  • >1k berichten
  • 1122 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 06 september 2006 - 09:21

4) Een kolom wordt niet kapot gedrukt hoor bij een hoge druk. Kolommen worden gepakt met een druk die vele malen hoger is dan een normale HPLC kan leveren, dit om het silica bed zo te zetten dat het niet ingedrukt kan worden. Vraag je maar eens af waar een hoge druk vandaan komt..... Dit komt door verstoppingen etc. Dus je kolom is op het moment dat de druk omhoog gaat gewoon niet meer de oude. Kolom lengte is dus een constante en geen variabele!

En niet te vergeten: de druk die de software jou presenteert is de druk die op de pomp staat! De pomp probeert de flow rate constant te houden en moet daar door de verstoping ergens in je systeem een enorme druk voor leveren waardoor hij zichzelf 'overbelast'. De hoge druk kan natuurlijk ook het gevolg zijn van een hoge flow rate. In dat geval is het de flow die voor de problemen zorgt.

#8

koberuben

    koberuben


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 november 2006 - 10:00

en verdund deze totdat je een verdunning hebt die goed gedetecteerd kan worden (vaak ligt het meetgebied waarin je goed kunt meten op zeer lage concentraties; denk aan milligrammen/liter)

Hallo,

voor mijn profielwerkstuk wil ik cafeÔne gaan scheiden met behulp van HPLC. Het enige dat ik nu nog hoef te doen is de concentraties van mijn ijkreeks en de verdunning van mijn monsters bepalen.
Nu gaat het mij vooral om het laatste, hoe weet ik hoe vaak ik mijn monster (een hoeveelheid bepaalde energiedrank) moet verdunnen?

Ik weet dat er in een blikje Red Bull 80 mg zuivere cafeÔne zit per 250 ml.

Misschien dat iemand mij kan helpen?

#9

Fuzzwood

    Fuzzwood


  • >5k berichten
  • 11101 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 14 november 2006 - 11:28

Ik kan me herinneren dat ik voor een schoolopdracht een caffeÔne ijkreeks gebruikte van 1-5 ppm. Dit is dus 1-5 mg/l.

Als je nu zorgt dat je je monster zů verdunt, dat je verwachte caffeÔneconcentratie +/-3 mg/l is, dan zit je mooi in het midden van de ijkreeks en krijg je de kleinste meetfout.

#10

koberuben

    koberuben


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 november 2006 - 14:49

Okee, super bedankt!
ook Cubefreak bedankt voor de bovenstaande info!

#11

Boanerges

    Boanerges


  • >250 berichten
  • 274 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 november 2006 - 18:38

Okee, super bedankt!
ook Cubefreak bedankt voor de bovenstaande info!

Als je een leuk drankje met een hoge concentratie caffeine wil hebben moet je eens bij een smartshop kijken.

Daar verkopen ze drankjes waar ongeveer 320mg/100ml caffeine in zit. Alleen werd dat niet op de verpakking vermeld. Waardoor het dus kwam dat ik de kolom teveel beladen had en hij er weinig zin meer in had.

#12

koberuben

    koberuben


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 14 november 2006 - 19:10

Klinkt ook leuk! 8-[
Hou het in mn achterhoofd :oops: Dankje

#13

Fuzzwood

    Fuzzwood


  • >5k berichten
  • 11101 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 14 november 2006 - 23:14

Mja als je dat wil fixen, ben je HEEL veel eluens kwijt, niet? Of tenminste veel milli-Q (speciaal gezuiverd water).

#14

Boanerges

    Boanerges


  • >250 berichten
  • 274 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 november 2006 - 18:53

Mja als je dat wil fixen, ben je HEEL veel eluens kwijt, niet? Of tenminste veel milli-Q (speciaal gezuiverd water).

Hij heeft de hele nacht doorgedraait de pomp, met eluens. Wat het zo was weet ik niet meer, ik kan me wel herinneren dat we flink wat hadden gemaakt.

Al met al is het wel goed gegaan, en uiteindelijk hebben we ook wel gemeten. Maar als we weer zoiets wouden doen moesten we het van tevoren heel sterk verdunnen.

#15

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 november 2006 - 19:06

Mja als je dat wil fixen, ben je HEEL veel eluens kwijt, niet? Of tenminste veel milli-Q (speciaal gezuiverd water).

Met water wel ja :oops:, gewoon 90% organisch, of de pH even aanpassen en het is zo van de kolom af.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures