Springen naar inhoud

transformatie van Ncor - CFP


  • Log in om te kunnen reageren

#1

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 08:23

ik heb als eerst digeste, ligatie uitgevoerd van Ncor met restrictie enzymen EcoRi + Sal1 + Sca1 en hetzelfde gedaan met CFP-C1 met EcoRi + Sal1. mijn vraag nu is de digestie van zowel NcoR als CFP-C1 zijn gelukt want op gel zien de bandjes er goed uit maar als ik hievan ligatie uitvoer en vervolgens aan een bactieriecultuur (E-coli) wil voegen zodat er transformatie plaats vindt. groeit er de volgende dag niks op de kanamycine resistente platen kunnen jullie me misschien helpen plzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzzz

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 10:42

Probeer iets duidelijker je vraag neer te zetten.
Hoe voer je je transformatie precies uit?
Zoals ik het begrijp is je ligatie product (vector + insert) goed, maar lukt je transformatie niet.

#3

Broekhem

    Broekhem


  • >100 berichten
  • 102 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 10:44

Het kan zijn dat NcoR en CFP-C1, niet resistent zijn voor Kana, of je transformatie is gewoon mislukt.

Ik weet het eerlijk gezegd ook niet,

Suc6 in ieder geval

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 10:50

Aan resistentie ligt het niet.
De CFP heeft een Kan. selectie gen.

zie:
http://orders.clonte.../pECFP-C1.shtml

#5

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 12:39

DIGESTIE V NcoR:
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR 10
EcoRi + Sal1+Sca1 0,5 + 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 6,5

Digestie v CFP
VOLUME (MICROLITER)
pECFP-C1 1,0
EcoRi + Sal1 0,5 + 0,5
Buffer H 2,0
Milli Q water 16

Ligatie v CFP-NcoR
VOLUME (MICROLITER)
pGEM-NcoR(instert) 10
pECFP-C1(vector) 0,5
Rapid Ligation buffer (5*) 4,0
Milli Q water 4,5
T4 DNA ligase 1,0

En dan heb ik transformatie uitgevoerd met 100microliter van E-coli en 4 microliter van de ligatiemengsel
kun iemand my vertellen wat ik fout doe of kloppen myn restrictieenzymen niet

#6

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 13:19

Natuurlijk kan ik zo niet zien of je enzymen wel of niet kloppen. Daarvoor moet je wel de MCS laten zien.
De MCS van de vector heb ik wel, je kan ligeren met de EcoRI en SalI dus daar moet het niet aan liggen.

Wat ik wel zie is dat je na het knippen van de vector geen SAP reactie doet (deforforyleren van je vector) en daarop volgend een EtOH prec. doet om je RE's te verwijderen.

Verder is het belangrijk een goed protocol te gebruiken bij je transformatie, als deze niet goed is, mislukt het vrij snel.

#7

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 13:47

he bedankt voor jullie snelle reactie dat stel ik zeer op prijs verder antw op je vraag Roy ja ik heb wel sap bij gedaan dat ben ik vergeten erbij te vermelden sorry about tht. Ik heb nog een vraag als mijn insert heel groot is kan het ook hierdoor komen dat mijn transformatie niet lukt en zo ja hoe kan ik dit probleem oplossen.
thxx 4 jullie moeite alvast


# Moderatoropmerking
Beryllium: kan je iets meer op je spelling letten? Iets minder MSN-taal en meer komma's en punten maken je posts leesbaarder.

Veranderd door Beryllium, 26 september 2006 - 22:10


#8

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 13:56

Hoe groot?
In de ECFP vector kunnen erg grote inserts.
Ik gebruikte bij mn EGFP een insert van 7 kb ofzo...
Als het te groot is moet je gebruik maken van alternatieve vectors zoals YAC's en BAC's. Je zou dan je ECFP gen kunnen knippen uit je vector en achter je insert kunnen plakken.
Ik denk zelf niet dat het hier aan ligt, inactiveer je je SAP alleen door bij 40 graden te zetten? Dit is vaak niet voldoende om ook je RE's te inactiveren...

#9

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 14:11

De grootte van NcoR is 10092bp maar de grootte van CFP-C1 weet ik niet verder ik inactiveer SAP gedurende 15 minuten bij 65 graden (heat block)

#10

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 september 2006 - 14:39

Ik weet het zo niet uit mn hoofd, maar bij 15 min. op 65 graden deactiveer je volgens mij je RE's niet. Het kan dus zijn dat je insert tijdens de ligatie niet in de vector wordt geplaatst.
Verder is je lengte ok, dat hoort geen probleem te zijn.
Ik denk dat het dus licht aan je werkwijze (transformeren, deactiveren enz.).

#11

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 september 2006 - 09:42

nogmaals bedankt roy

Je hebt gelijk het ligt aan mijn werkwijze ik probeer nu inactivatie v SAP wat langer te doen ipv 15 min by 65graden probeer ik het wel by 30 min 68 graden hoe lijkt je dat zal dat werken denk je???? , verder denk ik dat tranformatie wel goed is maar de ligatie is het probleem dit wil niet lukken dus elke suggestie met betekking tot het lukken van de ligatie is welkom

groetjes JASMIN

#12

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 september 2006 - 09:59

Mijn standaard protocol:
+/- 30 min SAP deactiveren op 65 graden. (Meestal doe ik echter EtOH prec. omdat er ook nog RE's aanwezig zijn).

Ligatie:

1ul vector
1ul T4 ligase
2ul Buffer
.ul Insert
.ul MilliQ
--
20 ul

De insert / vector ratio houdt ik altijd op 3:1.
De ligatie voer ik uit bij 4 hrs. op kamer temp.

Transformatie:
- E.coli's uit -80 halen en op ijs plaatsen.
- 5 ul ligatie product toevoegen (nooit mixen!)
- Terug op ijs plaatsen voor 45 min
- 45 sec heatshock bij 42 graden en 2 min terug op ijs plaatsen
- 350 ul SOC medium (of LB) toevoegen
- 45 min incuberen in schutstoof
- Cellen uitplaten op LB-kan. platen

Volgende dag kolonies bekijken.

Ik hoop dat dit genoeg info is.

#13

jasmin

    jasmin


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 september 2006 - 15:28

bedankt ik zal je protocol volgen hopelijk lukt het nu wel thxxxxxxxx

#14

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 27 september 2006 - 15:43

succes! Laat maar horen van het resultaat is.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures