Taq polymerase produceren

Moderator: ArcherBarry

Reageer
Berichten: 12

Taq polymerase produceren

Hoi iedereen,

Wij hebben jullie hulp nodig, het zit namelijk zo:

Wij moeten een eindproject doen als afsluiting voor onze opleiding laboratoriumonderwijs.

Wij hebben gekozen om Taq polymerase te produceren.

Het pTAQ gen halen we uit de bacterie Thermus Aquaticus. Dit transformeren wij in een E.coli pUC 18.

Wij willen onze verschillende stappen controleren met behulp van een gelelectroforese. Deze gelelectroforese voeren wij uit met pUC 18, het losse pTAQ gen en pUC 18 met het ingebouwde gen. We hebben hierbij nog een ladder/marker nodig, maar dit hebben wij niet kunnen vinden.

Weten jullie misschien waar we dit soort informatie kunnen vinden?

Op het eind willen wij ons product controleren met behulp van een eiwitgel. Ook hierbij hebben we een ladder/marker nodig. Kunnen jullie ons misschien helpen om dit te vinden?

Wij willen het pTAQ gen amplificeren met de PCR. Hierbij gebruiken wij chromosomaal DNA van de Thermus Aquaticus als template. Wij hebben alleen geen idee wat voor PCR programma we hiervoor kunnen gebruiken. Elke hulp hierbij zal zeer gewaardeerd worden.

Als jullie nog tips of extra informatie hebben, zou dat erg welkom zijn.

Alvast bedankt. :oops:

Berichten: 740

Re: Taq polymerase produceren

Leuk project maar of het geheel mogelijk is denk ik niet aangezien de kosten zeer hoog zijn).

Ik weet niet hoe lang het gen is, maar een 1kb mass ladder (Fermentas ofzo) zal vast wel goed zijn. Je controle is veel makkelijker en beter door je ligatie product te knippen met je gebruikte RE's (hierdoor valt je gen eruit, de lengte kan je meten mbv je ladder). En nog door een knip van een ander RE voor het bekijken van de orientatie (alleen nodig als je twee dezelfde RE's voor de ligatie gebruikt).

Ik denk wel dat het lastig is om zomaar het chromosomaal DNA van de bacterie te isoleren, deze bacterien is denk ik niet op school aanwezig, je kan misschien beter het DNA, dat al in een vector zit, gewoon bestellen (wel erg duur). De primers die je moet bestellen zijn ook vrij duur en je moet ze zelf ontwerpen wat ook niet makkelijk is. Het programma is wat dat betreft nog het simpelste, dit kan gewoon een normaal programma zijn van 30 cycli. De Tm van je programma is afhankelijk van je primers.

Je product controleren op een PAGE gel heeft niet veel zin, hierop zie je ook andere banden dus je zal het eiwit moeten isoleren uit je lysaat, of je moet een antilichaam hebben zodat je kan blotten, deze zijn echter ZEER prijzig.

Ik denk dat je maar beter eerst een goed gesprek met je begeleider kan hebben over de mogelijkheden voordat je een plan gaat maken

Berichten: 12

Re: Taq polymerase produceren

Hoi Roy,

Bedankt voor het beantwoorden van onze vragen.

Het is eigenlijk niet zo lastig om het chromosomaal DNA van de bacterie te isoleren. De bacterie is inderdaad niet aanwezig op school, maar omdat dit ons afstudeer project is mogen wij de bacterie kopen.

De Thermus aquaticus is niet zo duur, ongeveer 34 euro.

De primers moet je inderdaad zelf ontwerpen, maar we hebben de sequenties al. We hoeven ze alleen maar te bestellen en dit kan ook gewoon via de school.

We gaan nog wel moeten uitzoeken welke Tm het beste is.

De product controleren op een PAGE gel heeft inderdaad niet veel zin, maar dit lijkt ons wel heel logisch en ook goedkoper. We zullen dit wel nog een keer goed bespreken. Waarschijnlijk komen we niet eens zover met ons project. We hebben namelijk maar een aantal dagen om het hele experiment te doen.

Volgens onze begeleiders is dit project prima te doen en heel veel dingen zijn al besteld. We beginnen met ons project over drie weken.

Bedankt voor je tips.

Groetjes

P.S. extra informatie en tips zijn altijd welkom.

Berichten: 740

Re: Taq polymerase produceren

Ik las toevallig gisteren dat er bedrijven zijn die een Taq ook zelf produceren voor eigen gebruik. Deze bedrijven hebben een vector met het polymerase gen gekocht en schalen dit zelf op. Of ze het ook zuiveren weet ik niet precies.

Een van deze was de afdeling structuur biologie van het VU medisch centrum. Je kan misschien met hun contact opnemen voor de zuiverings procedure.

Berichten: 12

Re: Taq polymerase produceren

Hoi Roy,

Bedankt voor je tip, maar het is echt niet nodig.

We hebben zelf een zuiveringsprocedure samengesteld en dit is goed gekeurd door onze begeleiders.

Er werd ook tegen ons gezegd dat we een vector met het polymerase gen kunnen kopen. Maar we willen met ons project voornamelijk concentreren op het isoleren en zuiveren gedeelte. Dat vinden wij het leukst. :oops:

Groetjes

Berichten: 740

Re: Taq polymerase produceren

Ok veel succes daarmee dan!

Berichten: 12

Re: Taq polymerase produceren

Zijn er nog meer mensen die kunnen helpen met onze vragen??

Alle hulp is welkom.

Berichten: 740

Re: Taq polymerase produceren

Wat voor vragen heb je nog precies?

Berichten: 12

Re: Taq polymerase produceren

Misschien wat informatie over de achterliggende theorie en Taq polymerase.

Weten julie misschien ook wat meer over de bacterie Thermus Aquaticus of waar ik dit kan vinden? Er is hierover namelijk niet veel informatie te vinden.

Met wat voor (microbiologische) testen kan je hem bijvoorbeeld determineren?

Groetjes


Berichten: 12

Re: Taq polymerase produceren

He, bedankt voor de links.

Ik kan daar echt heel veel informatie vinden.

Bedankt!

Groetjes

Reageer