Springen naar inhoud

peptide mapping


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Mosselman

    Mosselman


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 november 2006 - 17:47

Hallo,

Weet er iemand waarom er bij een eiwit oplossing en buffer met ph 6,8
glycerol en ook SDS, maar da weet ik gedaan wordt?

Het gebruikte enzym is chymotrypsin.
Daarna volg er nog SDS-page.


Die pH van 6,8 is waarschijnlij nodig omdat bij die pH het enzym optimaal werkt, maar ik weet niet waarom er glycerol aan toegevoegd wordt?


thx

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 november 2006 - 20:08

Glycerol: dan zakt je monster goed in je gelslot.
SDS: maakt het eiwit negatief zodat het door de gel kan lopen.
Als je meer info wilt moet je het maar laten horen.

#3

Happyjeroen

    Happyjeroen


  • >100 berichten
  • 168 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 november 2006 - 21:12

SDS verzwaart ook de stof nog evenredig met de molmassa, zodat het beter door de gel loopt.

#4

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 november 2006 - 22:17

Waarom loopt een verzwaarde stof dan beter door een gel?

#5

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 november 2006 - 22:38

Een link met het antwoord

http://lifesciences....ag/sds-pag.html

#6

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 november 2006 - 23:00

Ik zie het antwoord niet.......

Van alles wat daar staat ben ik overigens nog wel op de hoogte.

Ik weet overigens wel dat men niet graag meer gels runt omdat een groot deel van zware peptides of proteines de gel niet eens in migreerd vanwege het gewicht. Het nog verder opzwaren opzich zorgt niet voor een betere gel migratie in mijn ogen.

Dus mijn vraag is, waarom is het verzwaren van een stof met SDS positief of de electroforese. Van het verbreken van de tertiere structuur en ladingen ben ik op de hoogte.

Trouwens als je lineair de massa loopt te verhogen, kan je ook gewoon een gel met een andere bereik nemen. Ik zie echt het voordeel niet.

Veranderd door Napoleon1981, 29 november 2006 - 23:06


#7

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 november 2006 - 08:48

Er worden hier een paar dingen door elkaar gehaald.
SDS wordt toegevoegd aan een protein mengsel om alle eiwitten dezelfde negatieve lading te geven. Per gram eiwit bindt ongeveer 1.4 gram SDS. Daardoor vindt scheiding in de gel uitsluitend op relatieve massa plaats en niet op lading van het eiwit. Verder worden secundaire en tertiaire structuren verbroken door het verbreken van de H-bruggen en het ontvouwen van het eiwit.
De pH 6.8 heeft een geheel andere functie en zorgt namelijk voor het concentratie effect van het sample aan het begin van de electroforese. De gel is verdeeld in twee delen, een stacking gel (pH 6.8) en een scheidings gel (pH 8.8). De running buffer bevat Tris-Glycine, de gel bevat alleen Tris-HCl. Glycine heeft een pI van 6.7 en heeft dus nauwelijks lading bij pH 6.8; de pH van de stacking gel. Daardoor heeft glycine een lagere mobiliteit en treedt concentratie van het sample op tussen stacking en separating gel. Het verschil in polyacrylamide concentratie tussen de twee gelen versterkt dit effect nog eens.
Voor verdere info verwijs ik graag naar Electrophoresis in Practice door Reiner Westermeier (GE Healthcare).

sjouke

#8

Mosselman

    Mosselman


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 december 2006 - 09:48

eventjes voor de duidelijkheid geef ik de volledige werkwijze:

•0,5 mg van een eiwit wordt opgelost in 1 mi 0,125 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 en 0,7 % SDS, 10 % glycerol (en 0,0001 % bromophenol blue).
•Het mengsel wordt 2 min. bij 100°C verwarmd.
•3 - 30 µg/ml papain of 10 - 40 µg chymotrypsin wordt toegevoegd bij 37°C en geroerd gedurende 30 min.
•De grootte van de peptidestukken kan veranderd worden door de incubatietijd en de enzymconcentratie aan te passen.
•Na de gewenste incubatietijd wordt er 2-mercapto-ethanol (tot 10 %) en SDS (tot 2 %) toegevoegd.
•De monsters worden 2 min. gekookt om de proteolyse te stoppen.
•20 tot 30 µl wordt gespot op een SDS-PAGE gel. Het gel wordt gekleurd met een zilverkleuring.



dus die pH 6,8 geeft niets te maken met de optimale pH waar het enzyme het eiwit knipt??

#9

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2006 - 10:26

Voor papain is die pH op zich wel in orde, voor chymotrypsin digestie is het duidelijk te laag.
Wat voor soort gel heb je eigenlijk? Je krijgt namelijk met deze proteasen vrij kleine peptiden - kun je die nog goed scheiden op je gel of gebruik je een bijzondere gel?

sjouke





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures