Hallo,
Weet er iemand waarom er bij een eiwit oplossing en buffer met ph 6,8
glycerol en ook SDS, maar da weet ik gedaan wordt?
Het gebruikte enzym is chymotrypsin.
Daarna volg er nog SDS-page.
Die pH van 6,8 is waarschijnlij nodig omdat bij die pH het enzym optimaal werkt, maar ik weet niet waarom er glycerol aan toegevoegd wordt?
thx
Laatste berichten
-
08:29
Programmeren met vectoren 5
-
23:12
speciale rel. theorie 10
-
22:57
Straatklok loopt 5 minuten voor 11
-
22:57
wig 6
-
22:36
Gravity and gravitation 4
-
22:24
[scheikunde] vraag Chemie - wat is de oplossing? 10
-
19:47
Bruine vlekken op treinaanwijzerbord 10
-
19:44
Vogels in de stad zijn goede klussers 2
-
19:12
Rood laserlicht 3
-
17:30
Herleiden afmetingen vanaf een foto 21
-
16:34
[wiskunde] Prijs Product per KG; Alternatief Inzicht 3
-
13:57
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 9
-
13:16
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 17
-
13:12
[natuurkunde] kroon van koning op Syracuse 10
-
10:15
2013 – Augustus Vraag 3 3
-
24 apr
Vraag 2009 Juli Vraag 5 5
-
24 apr
positie 2
-
24 apr
Schroefdraad berekening 8
-
24 apr
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
23 apr
Weerfrustratie 9
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
peptide mapping
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 740
Re: peptide mapping
Glycerol: dan zakt je monster goed in je gelslot.
SDS: maakt het eiwit negatief zodat het door de gel kan lopen.
Als je meer info wilt moet je het maar laten horen.
SDS: maakt het eiwit negatief zodat het door de gel kan lopen.
Als je meer info wilt moet je het maar laten horen.
-
- Berichten: 168
Re: peptide mapping
SDS verzwaart ook de stof nog evenredig met de molmassa, zodat het beter door de gel loopt.
-
- Berichten: 2.399
Re: peptide mapping
Waarom loopt een verzwaarde stof dan beter door een gel?
-
- Berichten: 2.399
Re: peptide mapping
Ik zie het antwoord niet.......
Van alles wat daar staat ben ik overigens nog wel op de hoogte.
Ik weet overigens wel dat men niet graag meer gels runt omdat een groot deel van zware peptides of proteines de gel niet eens in migreerd vanwege het gewicht. Het nog verder opzwaren opzich zorgt niet voor een betere gel migratie in mijn ogen.
Dus mijn vraag is, waarom is het verzwaren van een stof met SDS positief of de electroforese. Van het verbreken van de tertiere structuur en ladingen ben ik op de hoogte.
Trouwens als je lineair de massa loopt te verhogen, kan je ook gewoon een gel met een andere bereik nemen. Ik zie echt het voordeel niet.
Van alles wat daar staat ben ik overigens nog wel op de hoogte.
Ik weet overigens wel dat men niet graag meer gels runt omdat een groot deel van zware peptides of proteines de gel niet eens in migreerd vanwege het gewicht. Het nog verder opzwaren opzich zorgt niet voor een betere gel migratie in mijn ogen.
Dus mijn vraag is, waarom is het verzwaren van een stof met SDS positief of de electroforese. Van het verbreken van de tertiere structuur en ladingen ben ik op de hoogte.
Trouwens als je lineair de massa loopt te verhogen, kan je ook gewoon een gel met een andere bereik nemen. Ik zie echt het voordeel niet.
-
- Berichten: 125
Re: peptide mapping
Er worden hier een paar dingen door elkaar gehaald.
SDS wordt toegevoegd aan een protein mengsel om alle eiwitten dezelfde negatieve lading te geven. Per gram eiwit bindt ongeveer 1.4 gram SDS. Daardoor vindt scheiding in de gel uitsluitend op relatieve massa plaats en niet op lading van het eiwit. Verder worden secundaire en tertiaire structuren verbroken door het verbreken van de H-bruggen en het ontvouwen van het eiwit.
De pH 6.8 heeft een geheel andere functie en zorgt namelijk voor het concentratie effect van het sample aan het begin van de electroforese. De gel is verdeeld in twee delen, een stacking gel (pH 6.8) en een scheidings gel (pH 8.8). De running buffer bevat Tris-Glycine, de gel bevat alleen Tris-HCl. Glycine heeft een pI van 6.7 en heeft dus nauwelijks lading bij pH 6.8; de pH van de stacking gel. Daardoor heeft glycine een lagere mobiliteit en treedt concentratie van het sample op tussen stacking en separating gel. Het verschil in polyacrylamide concentratie tussen de twee gelen versterkt dit effect nog eens.
Voor verdere info verwijs ik graag naar Electrophoresis in Practice door Reiner Westermeier (GE Healthcare).
sjouke
SDS wordt toegevoegd aan een protein mengsel om alle eiwitten dezelfde negatieve lading te geven. Per gram eiwit bindt ongeveer 1.4 gram SDS. Daardoor vindt scheiding in de gel uitsluitend op relatieve massa plaats en niet op lading van het eiwit. Verder worden secundaire en tertiaire structuren verbroken door het verbreken van de H-bruggen en het ontvouwen van het eiwit.
De pH 6.8 heeft een geheel andere functie en zorgt namelijk voor het concentratie effect van het sample aan het begin van de electroforese. De gel is verdeeld in twee delen, een stacking gel (pH 6.8) en een scheidings gel (pH 8.8). De running buffer bevat Tris-Glycine, de gel bevat alleen Tris-HCl. Glycine heeft een pI van 6.7 en heeft dus nauwelijks lading bij pH 6.8; de pH van de stacking gel. Daardoor heeft glycine een lagere mobiliteit en treedt concentratie van het sample op tussen stacking en separating gel. Het verschil in polyacrylamide concentratie tussen de twee gelen versterkt dit effect nog eens.
Voor verdere info verwijs ik graag naar Electrophoresis in Practice door Reiner Westermeier (GE Healthcare).
sjouke
-
- Berichten: 9
Re: peptide mapping
eventjes voor de duidelijkheid geef ik de volledige werkwijze:
0,5 mg van een eiwit wordt opgelost in 1 mi 0,125 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 en 0,7 % SDS, 10 % glycerol (en 0,0001 % bromophenol blue).
Het mengsel wordt 2 min. bij 100°C verwarmd.
3 - 30 µg/ml papain of 10 - 40 µg chymotrypsin wordt toegevoegd bij 37°C en geroerd gedurende 30 min.
De grootte van de peptidestukken kan veranderd worden door de incubatietijd en de enzymconcentratie aan te passen.
Na de gewenste incubatietijd wordt er 2-mercapto-ethanol (tot 10 %) en SDS (tot 2 %) toegevoegd.
De monsters worden 2 min. gekookt om de proteolyse te stoppen.
20 tot 30 µl wordt gespot op een SDS-PAGE gel. Het gel wordt gekleurd met een zilverkleuring.
dus die pH 6,8 geeft niets te maken met de optimale pH waar het enzyme het eiwit knipt??
0,5 mg van een eiwit wordt opgelost in 1 mi 0,125 M Tris-HCl buffer met pH 6,8 en 0,7 % SDS, 10 % glycerol (en 0,0001 % bromophenol blue).
Het mengsel wordt 2 min. bij 100°C verwarmd.
3 - 30 µg/ml papain of 10 - 40 µg chymotrypsin wordt toegevoegd bij 37°C en geroerd gedurende 30 min.
De grootte van de peptidestukken kan veranderd worden door de incubatietijd en de enzymconcentratie aan te passen.
Na de gewenste incubatietijd wordt er 2-mercapto-ethanol (tot 10 %) en SDS (tot 2 %) toegevoegd.
De monsters worden 2 min. gekookt om de proteolyse te stoppen.
20 tot 30 µl wordt gespot op een SDS-PAGE gel. Het gel wordt gekleurd met een zilverkleuring.
dus die pH 6,8 geeft niets te maken met de optimale pH waar het enzyme het eiwit knipt??
-
- Berichten: 125
Re: peptide mapping
Voor papain is die pH op zich wel in orde, voor chymotrypsin digestie is het duidelijk te laag.
Wat voor soort gel heb je eigenlijk? Je krijgt namelijk met deze proteasen vrij kleine peptiden - kun je die nog goed scheiden op je gel of gebruik je een bijzondere gel?
sjouke
Wat voor soort gel heb je eigenlijk? Je krijgt namelijk met deze proteasen vrij kleine peptiden - kun je die nog goed scheiden op je gel of gebruik je een bijzondere gel?
sjouke
