Springen naar inhoud

extractie van RNA uit een gebruikt monster.


  • Log in om te kunnen reageren

#1

fluffy spacemeisje

    fluffy spacemeisje


  • >25 berichten
  • 37 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2006 - 14:56

Ik probeer RNA te isoleren uit een monster dat al in een andere test is gebruikt.

Ik gebruik een weefsel-monster afkomstig van een schaap dat in een test is bewerkt (als extractiebuffer) met PBS en triton x-100.

Ditzelfde monster gebruik ik vervolgens opnieuw om RNA uit te isoleren. Ik gebruik hiervoor een buffer van Triton X100, guanidine thiocyanaat en TRIS.

Ik krijg bij een NASBA of PCR geen enkel resultaat. Als ik een monster echter verschillende malen met de " Triton X100, guanidine thiocyanaat en TRIS" buffer opzuiver lijkt er geen probleem te zijn.

Mijn eigenlijke vraag is nu of de "PBS en triton x-100" buffer een negatief effect kan hebben op het monster wanneer ik dit voor het RNA wil opzuiveren.

Geplaatste afbeelding

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 04 december 2006 - 15:49

RNA isolatie is een lastig proces. Hierbij moet je zeer secuur werken doordat er overal RNases aanwezig zijn (ook in water e.d.!).
Triton is een detergent. Dit gebruik je om je cellen kapot te maken zodat de inhoud vrijkomt. Het is mogelijk dat bij deze stap er RNases uit je cel vrijkomen die je RNA afbreken.
Gebruik daarom altijd buffer die RNase vrij is!

#3

Broekhem

    Broekhem


  • >100 berichten
  • 102 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 04 december 2006 - 16:26

Ik gebruik altijd Beta-mercaptoethanol en RLT-buffer (zit altijd bij de RNeasy kit), om de cellen te lyseren, en dan vervolgens het protocol volgen om het RNA te isoleren.

#4

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 04 december 2006 - 20:40

De kans is wel heel groot dat je RNA uit het eerder gebruikte monster is gedenatureerd. RNA is uiterst gevoelig.
Ik gebruikte ook de methode van Broekhem(Qiagen kit). Hierbij moet je snel werken en het gezuiverd RNA snel op ijs en vervolgens in de -80 het valt echt snel uit elkaar.
Ook een methode om het weefsel in te vriezen in vloeibare stikstof.
En vooral RNase vrij werken!

MvG Ron

#5

fluffy spacemeisje

    fluffy spacemeisje


  • >25 berichten
  • 37 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 december 2006 - 11:53

Allereerst bedankt voor jullie snelle reacties:

- Ik werk volledig RNase vrij. Alles wat ik gebruik is gamma-gesteriliseerd, nitril-handschoenen worden voortdurend gewisseld en er wordt enkel met PCR-schone filtertip pippetpuntjes gewerkt. Ik gebruik alleen gesteriliseerd SuperQ water en de ruimtes voor een PCR worden fysisch gescheiden.

- Het punt is dat wanneer ik de " Triton X100, guanidine thiocyanaat en TRIS" buffer gebruik ik wel meerdere malen een monster kan opzuiveren.

Zodra ik echter die echter door PBS en triton x-100 vervang is mijn signaal in de NASBA weg.

Het heeft verder geen zin om mijn monster in stikstof in te vriezen omdat ik het binnen 2 dagen in beide testen gebruik.

Vervelend punt blijft het. Ik vermoed dat het probleem bij de buffers ligt. Alleen heb ik geen idee of en welke invloed PBS en TRIS op elkaar kunnen hebben.

Laat komen die feedback :oops:

#6

lucvds

    lucvds


  • 0 - 25 berichten
  • 1 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 september 2009 - 18:02

Wie kan me meer info bezorgen :

"Systeem voor totale RNA extractie zoals eurozol tonic".

Wat betekent dit?

Wat is dit wat doet dit. Het zou bestemd zijn voor duiven?

Wie geeft me meer info?

Luc

#7

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 25 september 2009 - 20:05

Een product van de firma Annovum

EUROzol extracts total RNA from tissues or isolated cells trough the action of concentrated caothropic agents. Simultaneously to RNA extraction, DNA and proteins are precipitated by acid phenol. The high concentration of caothropic agents allows extraction from larger volumes of sample. The RNA extraction must be followed by its purification. It could be achieved by low temperature precipitation in isopropanol or by a faster protocol based on a high affinity binding resin (see Euroclone Total RNA Purification Kit - Code EMR056100) the last method should be preferred if high RNA recovery from a small number of cells is required.
The RNA obtained is undegraded, free of proteins and DNA and contains all the different species of RNA

http://www.annovum.n...P.html#EUROzol_

http://www.annovum.n...ULARBIOLOGY.pdf





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures