Mechanische & enzymatische lysis

watermonster

Hallo,

graag wil ik vragen of iemand mij kan helpen.

Ik ben een tijdje bezig met de lysis van de grampositieve bacterien B.cereus (reincultuur). Het is bekend dat grampositieve cellen moeilijker lyseren dan gramnegatieve.

Ik gebruik de volgende technieken om de cellen te lyseren:

Mechanische lysis: m.b.v glasparels in een schudapparaat (Fastprep)

lysis: - m.b.v Guanidine Thiocyanate

enzymatische lysis: - m.b.v lysozym

Dit zijn de buffers die ik gebruik:

Buffer 1: Tris-EDTA buffer

Buffer 2: Tris-EDTA-NaCL-Sucrose

Bij de mechanische lysis, lyseer ik de cellen eerst m.b.v galsparels dan doe ik een full-automatische DNA/RNA opzuivering met een apparaat (EasyMag)

Bij enzymatische lysis doe ik de cellen in buffer 1 dan voeg ik lysozym toe bij 37 graden en half uur incuberen en dan doe ik ook een full-automatische opzuivering.

Het zelfde doe ik ook met buffer 2.

Ook voeg ik direct lysozym toe, dus zonder de toevoeging van de buffers.

Na de opzuivering doe ik met behulp van Subergreen II nucleinezuur detectie. en het resultaat is dat mechanische lysis het meest effectief is (geeft de meeste counts) gevolgd door enzymatische lysis met lysozyme zonder de toevoeging van de buffers.

Nu wil ik vragen waarom niet alle cellen bij de enzymatische methode lyseren. Want ik voeg een overmaat lysozym toe. Als de ene cel lyseert met het zelfde enzym moet de andere cel toch ook lyseren. Of is het dat bij de enzymatische lysis de nucleinezuur niet volledig los komt van het celmembraan ( met zijn staart).

Want hoe meer ik ook lysozym toevoeg het resultaat blijft hetzelfde. Dit betekent dat of het celmembraan van sommige cellen niet kapot gaat. of dat ze niet helemaal kapot gaan waardoor de nucleinezuur vrij kan komen.

kan iemand mij helpen??

Roy van Heesbeen

Het klopt idd dat enzymatische niet altijd even goed werkt. Voor E.coli is dit een goede methode, maar gram + bacterien zijn moeilijker en spirochetten zijn zelfs onmogelijk. Je kan ook altijd nog de alkalische lysis proberen door SDS en NaOH toe te voegen.

Waarvoor wil je de bacterien eigelijk gebruiken? DNA isolatie? Plasmide isolatie? eiwit isolatie?

watermonster

Voor de beplaling en vergelijking van een nieuwe lysis-apparaat. En uiteindelijk voor een NASBA-amplificatie. RNA-isolatie dus. Maar waarom lyseert de ene bacterie moeilijker dan de andere ( wel bacterien van hetzelfde soort, in mijn geval B.cereus). Ik gebruik ook altijd verse bacterien van een overnachtcultuur. Ik gebruik het enzym lysozym om de celmembraan kapot te maken. Maar maakt lysozym de hele celmembraam kapot(lost het celmembraam op), of zorgt het voor een breuk in de celmembraan. Als het alleen voor een breuk zorgt dan kan ik begrijpen dat het niet zo effetctief is als bij mechanische lysis. Want de celmembraan moet voldoende open zodat het nucleinezuur eruit kan komen. En bij mechnishce lysis scheurt de celmembraam volledig open en kan het DNA/RNA volledig geisoleerd worden.

Dus graag wil ik vragen waarom lysozym de ene bacterie wel lyseert en een andere niet ( wel bacterien van hetzelfde soort, in mijn geval B.cereus)

bedankt

Roy van Heesbeen

Lysozyme hydrolyseerd de peptidoglycan bindingen van bacterien.

Het maakt dus het celmembraan poreus, waardoor er vervolgens door osmose scheuren ontstaan in het membraam. In het lichaam wordt een bacterie na blootstelling aan lysozym makkelijker te phagocyteren.

Alle bacterien hebben een andere celwand, dus bij de een gaat het sneller als bij de ander. Bacterien met kapsel zoals de S.aureaus zijn nog een stuk lastiger.

Bacterien zonder peptidoglycan kunnen niet gelyseerd worden met lysozym.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Mechanische & enzymatische lysis

Mechanische & enzymatische lysis

Re: Mechanische & enzymatische lysis

Re: Mechanische & enzymatische lysis

Re: Mechanische & enzymatische lysis