Springen naar inhoud

ELISA - peroxidase


  • Log in om te kunnen reageren

#1

FincH

    FincH


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 juni 2007 - 11:05

Hallo,

ik heb een vraagje ivm ELISA. Ik weet dat er al veel van opstaat mr dit vondik niet.
Bij een ELISA reactie voeg je (ik weet dat er nog stappen voor zijn) conjugaat toe: een antistof (peroxidase-gelabeld anti-humaan IgA (konijn)) gericht tegen de menselijke antistoffen. Deze antistof is gekoppeld aan een enzym.
Na het wassen voeg je dan nog eens het substraat (TMB/ H2O2) toe en wordt door het enzym, gebonden op de 2de antistof, omgezet waardoor een kleur wordt gegenereerd. Dit staat dus in mij curcus. Dit geheel snap ik wel, maar ik zou graag weten via welke reactie precies kleur wordt gegenereerd. Ik zou denken
peroxidase
H202 ------------> H20 + 02 (ontstaan gekleurd product) Hoe ontstaat dat gekleurd precies?

Alvast bedankt voor jullie tijd en hulp.

Mvg,

FincH

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Pink Panther

    Pink Panther


  • >250 berichten
  • 516 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 juni 2007 - 12:06

veelal wordt gewerkt met Horse Radisch Peroxidase. Dit zal tetramethylbenzidine oxideren met H2O2. en die geoxideerde stof is fluorescent.

het zijn dus niet de producten han waterstofperoxide die fluorescent zijn, maar het andere substraat van HRP.

Veranderd door Pink Panther, 19 juni 2007 - 12:07


#3

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 19 juni 2007 - 14:12

TMB (3,3",5,5"-tetramethylbenzidine) is een colorometrisch substraat dat wordt geoxideerd door peroxidase en dat afgelezen wordt bij 625 nm (blauw) en na toevoeging van 2 M zwavelzuur bij 450 nm (geel).
De feitelijke reactie kan ik niet zo snel vinden maar ik zal eens verder zoeken.

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 juni 2007 - 16:55

Volgens mij deed het HRP niks met TMB.

Ik dacht dat het als volgt ging:
HRP zet waterstofperoxide om naar water en één vrij zuurstofradicaal.
Dit zuurstofradicaal oxideerd vervolgens mij dan TMB.

De zwavelzuur toevoeging dient om het het HRP te inactiveren.

#5

Pink Panther

    Pink Panther


  • >250 berichten
  • 516 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 juni 2007 - 18:40

Volgens mij deed het HRP niks met TMB.

Ik dacht dat het als volgt ging:
HRP zet waterstofperoxide om naar water en één vrij zuurstofradicaal.
Dit zuurstofradicaal oxideerd vervolgens mij dan TMB.

De zwavelzuur toevoeging dient om het het HRP te inactiveren.

Hoedanook is TMB nodig voor de reactie te laten kleuren en dus meetbaar te maken.
maar ik dacht dat waterstofperoxide het HRP ging oxideren zodat HRP TMB kon oxideren. dat is de normale weg die gevolgd wordt door HRP (volgens mijn cursus biochemische en microbiële analyse), niet?

#6

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 19 juni 2007 - 19:30

Volgens mij deed het HRP niks met TMB.

Roy je hebt helemaal gelijk, ik ging een beetje kort door de bocht. Het peroxide is gewoon een standaard bestanddeel van de TMB substraten.

Flink zoeken leverde het volgende op over het reactiemechanisme:

TMB is the most sensitive chromogenic substrate for detection of horseradish
peroxidase (HRP)-labeled probes. In the presence of HRP and hydrogen peroxide
(H2O2), TMB is oxidized first to a blue, cation free radical having an absorption
maximum at 653 nm (ε = 3.9 x 104 M-1cm-1). Upon further reaction with
HRP/H2O2, or addition of acid, the radical is converted to a terminal oxidation
product, a yellow diimine that absorbs light at 450 nm (ε = 5.9 x 104 M-1cm-1).
Increased sensitivity (2 - 4 fold) is afforded by the yellow diimine, as its molar
extinction coefficient is greater than that of the blue radical.
This TMB substrate is a safe, single-component system for use in HRP-based
ELISA. It is optimized with respect to TMB and H2O2 concentrations and yields a
linear response with the concentrations of HRP usually employed in immunologic
assays. Upon reaction with HRP and H2O2, the reagent yields a blue soluble end
product that is measured at 650 nm. The color formation as a function of time can
be recorded or the reaction can be stopped with sodium fluoride for endpoint
determinations. Increased sensitivity can be achieved by stopping the reaction
with acid, which converts the blue radical to the yellow diimine that is measured at
450 nm.

bron: http://search.cosmob...44.20050405.pdf

typo

Veranderd door Gerard, 19 juni 2007 - 19:31


#7

FincH

    FincH


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 19 juni 2007 - 20:10

Merci! Bedankt voor de hulp





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures