Hallo,
ik heb een vraagje ivm ELISA. Ik weet dat er al veel van opstaat mr dit vondik niet.
Bij een ELISA reactie voeg je (ik weet dat er nog stappen voor zijn) conjugaat toe: een antistof (peroxidase-gelabeld anti-humaan IgA (konijn)) gericht tegen de menselijke antistoffen. Deze antistof is gekoppeld aan een enzym.
Na het wassen voeg je dan nog eens het substraat (TMB/ H2O2) toe en wordt door het enzym, gebonden op de 2de antistof, omgezet waardoor een kleur wordt gegenereerd. Dit staat dus in mij curcus. Dit geheel snap ik wel, maar ik zou graag weten via welke reactie precies kleur wordt gegenereerd. Ik zou denken
peroxidase
H202 ------------> H20 + 02 (ontstaan gekleurd product) Hoe ontstaat dat gekleurd precies?
Alvast bedankt voor jullie tijd en hulp.
Mvg,
FincH
Laatste berichten
-
00:15
[scheikunde] Kan chloorgas de geleiding van elektriciteit belemmeren? 9
-
22:27
positie 1
-
21:15
Weerfrustratie 9
-
18:24
Schroefdraad berekening 5
-
18:08
geen minkowski-ruimte toch? Doe ik dit nou fout? 15
-
14:16
do-re-mi-fa-so vliegtuigen 7
-
14:16
Kunnen quantum Zonnecellen 190% quantum efficiënt zijn 3
-
13:57
De Euro Nederlandse 100 qubit computer komt eraan
-
10:42
projectiel 8
-
10:37
Verschil tussen deze 2 vragen 5
-
09:25
[scheikunde] berekeningen labo vitamine c bepaling 1
-
22 apr
[wiskunde] rode en witte ballen verdelen 8
-
22 apr
Rotatie van het heelal 41
-
22 apr
Muntje opgooien 14
-
21 apr
Reactiviteit silyl enol ethers 1
-
21 apr
Criterium voor vochtretentie
-
21 apr
speciale rel. theorie 5
-
21 apr
Vogels in de stad zijn goede klussers
-
21 apr
Ervaringen met "herontdekkingen" 15
-
20 apr
Herleiden afmetingen vanaf een foto 19
Nieuwsberichten
-
04 mar
Een nieuw soort magnetisme: altermagnetisme
-
31 okt
AI kan via stem diabetes vaststellen 11
-
21 okt
Einstein krijgt wéér gelijk 45
-
07 feb
witter dan wit 20
-
19 jun
irrigatie en de aardas
ELISA - peroxidase
Moderator: ArcherBarry
-
- Berichten: 516
Re: ELISA - peroxidase
veelal wordt gewerkt met Horse Radisch Peroxidase. Dit zal tetramethylbenzidine oxideren met H2O2. en die geoxideerde stof is fluorescent.
het zijn dus niet de producten han waterstofperoxide die fluorescent zijn, maar het andere substraat van HRP.
het zijn dus niet de producten han waterstofperoxide die fluorescent zijn, maar het andere substraat van HRP.
Re: ELISA - peroxidase
TMB (3,3",5,5"-tetramethylbenzidine) is een colorometrisch substraat dat wordt geoxideerd door peroxidase en dat afgelezen wordt bij 625 nm (blauw) en na toevoeging van 2 M zwavelzuur bij 450 nm (geel).
De feitelijke reactie kan ik niet zo snel vinden maar ik zal eens verder zoeken.
De feitelijke reactie kan ik niet zo snel vinden maar ik zal eens verder zoeken.
-
- Berichten: 740
Re: ELISA - peroxidase
Volgens mij deed het HRP niks met TMB.
Ik dacht dat het als volgt ging:
HRP zet waterstofperoxide om naar water en één vrij zuurstofradicaal.
Dit zuurstofradicaal oxideerd vervolgens mij dan TMB.
De zwavelzuur toevoeging dient om het het HRP te inactiveren.
Ik dacht dat het als volgt ging:
HRP zet waterstofperoxide om naar water en één vrij zuurstofradicaal.
Dit zuurstofradicaal oxideerd vervolgens mij dan TMB.
De zwavelzuur toevoeging dient om het het HRP te inactiveren.
-
- Berichten: 516
Re: ELISA - peroxidase
Hoedanook is TMB nodig voor de reactie te laten kleuren en dus meetbaar te maken.Roy van Heesbeen schreef: Volgens mij deed het HRP niks met TMB.
Ik dacht dat het als volgt ging:
HRP zet waterstofperoxide om naar water en één vrij zuurstofradicaal.
Dit zuurstofradicaal oxideerd vervolgens mij dan TMB.
De zwavelzuur toevoeging dient om het het HRP te inactiveren.
maar ik dacht dat waterstofperoxide het HRP ging oxideren zodat HRP TMB kon oxideren. dat is de normale weg die gevolgd wordt door HRP (volgens mijn cursus biochemische en microbiële analyse), niet?
Re: ELISA - peroxidase
Roy je hebt helemaal gelijk, ik ging een beetje kort door de bocht. Het peroxide is gewoon een standaard bestanddeel van de TMB substraten.Roy van Heesbeen schreef:Volgens mij deed het HRP niks met TMB.
Flink zoeken leverde het volgende op over het reactiemechanisme:
TMB is the most sensitive chromogenic substrate for detection of horseradish
peroxidase (HRP)-labeled probes. In the presence of HRP and hydrogen peroxide
(H2O2), TMB is oxidized first to a blue, cation free radical having an absorption
maximum at 653 nm (ε = 3.9 x 104 M-1cm-1). Upon further reaction with
HRP/H2O2, or addition of acid, the radical is converted to a terminal oxidation
product, a yellow diimine that absorbs light at 450 nm (ε = 5.9 x 104 M-1cm-1).
Increased sensitivity (2 - 4 fold) is afforded by the yellow diimine, as its molar
extinction coefficient is greater than that of the blue radical.
This TMB substrate is a safe, single-component system for use in HRP-based
ELISA. It is optimized with respect to TMB and H2O2 concentrations and yields a
linear response with the concentrations of HRP usually employed in immunologic
assays. Upon reaction with HRP and H2O2, the reagent yields a blue soluble end
product that is measured at 650 nm. The color formation as a function of time can
be recorded or the reaction can be stopped with sodium fluoride for endpoint
determinations. Increased sensitivity can be achieved by stopping the reaction
with acid, which converts the blue radical to the yellow diimine that is measured at
450 nm.
bron: http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_...44.20050405.pdf
typo
