Springen naar inhoud

Reactiesnelheid Bepalen


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Kacheltje

    Kacheltje


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 22 augustus 2007 - 16:47

Hallo,

Ik heb een experiment uitgevoerd met als doel de Km en Vmax moet bepalen.

Alleen heb ik 'in mijn ogen' vreemde resultaten gekregen.

Bij de grotere consentraties substraat (in dit geval PNPP (paranitrofenylfosfaat)) wordt de hoeveelheid verkregen product (PNP (wat ik met een spectrofotometer bepaal) minder. Tot en met concentraties van 30mM PNPP zijn alle resultaten aannemelijk. Maar bij de concentraties 40mM en 50mM krijg ik als resultaat dat er geen enkel PNP is gevormd.

Wat zie ik over het hoofd?

Alvast bedankt voor jullie hulp.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 22 augustus 2007 - 20:35

Je geeft wel erg weinig informatie over je expiriment, als je wilt dat we meedenken zul het expiriment wel exact moeten beschrijven.
2 puntjes: Wel enzym toegevoegd? pH OK?

#3

Kacheltje

    Kacheltje


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 22 augustus 2007 - 20:59

Ik zal hieronder het proberen te beschrijven.

Ja, enzym toegevoegd :D en pH van alle buffers zijn gecontroleerd.

Ik heb 15 reageer buizen genomen.
5 verschillende substraat concentraties gemaakt (10,20,30,40,50mM PNPP)
buis 1,2,3 1ml 10mM PNPP
buis 4,5,6 1ml 20mM PNPP
buis 7,8,9 1ml 30mM PNPP
buis 10,11,12 1ml 40mM PNPP
buis 13,14,15 1ml 50mM PNPP

buis 3,6,9,12,15 1ml buffer met fosfaat toevoegen (dit om de werking van fosfaat op de reactie te onderzoeken).
in de overige buizen 1ml buffer zonder fosfaat. (de buffer is hier een 0,1M AMP buffer met 1mM MgCl2 pH 10,8).
In buizen 1,4,7,10,13 (blanco's) demiwater toevoegen. In overige buizen 1ml enzymoplossing. Deze buizen exact 10minuten laten staan bij 37 graden C. En na exact 10minuten de reactie stoppen met 10ml 2M NaOH.

Vervolgens met buis 1 spectrofotometer op 0 instellen en dan buis 2 en 3 meten.
met buis 4 spectrofotometer op 0 instellen en buis 5 en 6 meten.
enz.

Alleen mijn resultaten van de buizen 10+ zijn (volgens mij) niet goed.
Het viel me wel op dat er bij de buizen 10 en 13 (blanco's) een gele kleuring was opgetreden (dus wel PNP aanwezig). In buis 12 en 15 (met extra fosfaat in de buffer) is minder PNP aanwezig dan in de blaco's. 8-)

Volgensmij weet ik al wat ik fout kan hebben gedaan 8-[ .
Heb ik ipv 1ml demiwater in buis 10 en 13 perongeluk geen demiwater maar enzymoplossing gepippeteerd.

#4

Fuzzwood

    Fuzzwood


  • >5k berichten
  • 11101 berichten
  • Moderator

Geplaatst op 22 augustus 2007 - 21:49

Mja en omdat je dan dezelfde hoeveelheid PNP blanco stelt als dat je in de echte monsters hebt zitten, meet je dus niets.

Als je nu slim bent, zeg je precies wat er fout ging, waarom, en hoe je dit de volgende keer beter doet. Ga je fouten nooit opleuken/ophemelen.

#5

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 22 augustus 2007 - 22:02

Nog een advies om dit soort problemen te voorkomen/makkelijker op te lossen, meet alle buizen dus ook de bepalingblanco's tegen water, dan kun je achteraf beter reconstrueren wat er is gebeurt.

#6

Kacheltje

    Kacheltje


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 augustus 2007 - 14:23

Dankje voor jullie reacties,

Ja, het was idd achteraf wel handiger geweest om eventjes te meten tegen water. Maar dat heb ik dus niet gedaan.

Maar ik ben blij dat ik weet wat er fout is gegaan... nu kunnen we tenminste een mooie discussie opstellen :P

En ik doe er nog een voorbeeld berekeningetje bij dan komt dat ongetwijfeld allemaal goed.

Bedankt voor jullie hulp!! :D

#7

Cornflake

    Cornflake


  • 0 - 25 berichten
  • 1 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 15 september 2007 - 17:28

Hoi Kacheltje,

Hoe zijn je experimenten nu verlopen?

Ik heb je vraag en de daarop volgende discussie gelezen, maar mis toch enkele zaken, vragen en informatie:
1. Als enzym gebruik je waarschijnlijk Alkalisch Phosphatase (AP). Dit enzym gebruikt pNPP als substraat en wordt veel gebruikt bij immunologische testen. Het optimum van dit enzym ligt rond pH 8,0. Welk enzym gebruik jij en heb je het pH-optimum van dit enzym opgezocht?

2. Onder sterk basische omstandigheden moet je rekening houden met denaturatie van eiwitten en dus ook van enzymen. Enzymactiviteit gaat dan verloren. Waarin heb je de enzymoplossing gemaakt? Zat bij die oplossing ook een "beschermingseiwit", zoals bv. BSA - runderalbumine?

3. Wat zijn de eindhoeveelheden oplossing en dus de eindconcentraties geweest? Als je werkt met reageerbuizen, verbruik je meestal "enorme" hoeveelheden. Heb je de beschikking over kleinere buizen of nog liever microtiterplaten (250 microliter)?


4. Bij welke golflengte heb je gemeten. pNPP wordt meestal gemeten bij 450 nm. Heb je de beschikking over een spectrofotometer met selectieve lichtfrequenties of meet je met "wit" licht zonder filters? Ken je iemand of een organisatie met een zg. ELISA-apparaat? Die gebruiken microtiterplaten en kunnen bij verschillende lichtfrequenties een monster doormeten.

Mocht je meer willen weten over deze vragen of aanvullende informatie willen hebben, vraag dan gerust.

Succes!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures