Springen naar inhoud

[scheikunde] SDS-PAGE-gel zonder enig eiwitbandje?


  • Log in om te kunnen reageren

#1

xynnie

    xynnie


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 19:45

Ik heb een SDS-PAGE uitgevoerd. Nu is het enige probleem dat bij kleuring met CBB geen enkel eiwitbandje te zien was. Ook niet van de MW-marker.
Deze elektroforese is dus ook mislukt. Tijdens de running was overigens ook al helemaal nergens in de gel een blauwe kleur te zien, terwijl na het laden van de slotjes deze allemaal blauw waren. Zodra de elektroforese echter gestart werd, verdween de blauwe kleur binnen een paar minuten uit de gel.
Er was dus ook geen broomfenolblauw-front.

Wat zou hiervan de oorzaak kunnen zijn?
Er zaten wel eiwitten in de slotjes, want de monsters waarmee ik deze proef heb uitgevoerd hebben daarna ook nog een bradford-bepaling ondergaan en deze verliep wťl volgens plan.
Hoe kan het dan dat ik die na een elektroforese en kleuring (en ontkleuring) niet kan zien?

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 20:19

Klinkt misschien dom maar heb je de polariteit van de voeding gecontroleerd?

#3

xynnie

    xynnie


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 20:28

Ehm, wat is de polariteit van voeding als ik vragen mag :oops:

#4

xynnie

    xynnie


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 20:34

Overigens, ik heb denaturerende loading buffer met mercaptoethanol en het eiwit een week in de koelkast laten staan. Vervolgens heb ik het minder dan 5 minuten op minder dan 95 graden gekookt.
Kan een van deze twee dingen misschien invloed hebben op het feit dat ik geen eiwit zie?

Op zich... het koken zorgt alleen maar dat het eiwit uit het membraan komt, terwijl CBB ook aan membraansgebonden eiwit bindt, dacht ik.
En mercaptoethanol denatureert het eiwit alleen maar, volgens mij maakt dat niet het eiwit niet zichtbaar meer is...
Maar omdat dat volgens mij de enige afwijkingen zijn die ik had tov anderen, vroeg ik me dat toch af...

#5

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 20:52

Het feit dat je geen kleuring van eiwit krijgt kan 2 oorzaken hebben nl de opgebrachte concentraties liggen beneden de detectielimiet van CBB maar als de MW marker volgens de bijsluiter is gebruikt is dat onwaarschijnlijk en dan moet het eiwit in de buffer verdwenen zijn. De enige reden die ik daarvoor kan bedenken is dat je plus en de minpool van de voeding hebt omgedraaid.

#6

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 21:47

Nog een vraagje heb je in de gel gekleurd zo ja heb het eiwit gefixeerd?

#7

xynnie

    xynnie


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 21:55

In de gel gekleurd? Hoe bedoel je?

Ik heb na de elektroforese de gel in CBB gelegd.

Overigens moet ik wel zeggen dat ik de blauwe vloeistof (blauw door de loading buffer) ongeveer een paar minuten nadat de elektroforese was gestart niet meer zag. Toen was mijn gel al helemaal doorzichtig.
Heb begrepen dat dat ook niet helemaal goed was.

Geen idee wat er precies fout is gegaan...
Maar het ging niet zoals het moest.

#8

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 22:07

Als de electroforese heeft gelopen moet je voor je met CBB kleurt het eiwit fixeren met een fixatief (bv trichloorazijnzuuroplossing) anders spoel tijdens het kleuren het eiwit uit de gel.
Het broomfenolblauw in de loading buffer wil nog wel eens moeilijk te zien zijn maar ik gebruik een gekleurde MW-marker zodat je nog beter de elektroforese visueel kunt volgen.

#9

xynnie

    xynnie


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 22:12

Eh nee ik heb hem niet gefixeerd. Maar er zijn meer mensen geweest die hetzelfde hebben gedaan en bij hen deed de kleuring het wťl. Laat me zo zeggen: in de practicumhandleiding staat niks over iets om te fixeren. Gewoon gelijk na de elektroforese in de CBB en dat hebben anderen dus ook gedaan. Bij hen is het wel goed gekomen...

#10

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 11 oktober 2007 - 22:21

Je hebt gelijk op het net vond ik inderdaad dat gels direct gekleurd kunnen worden in CBB zonder fixatie.
Wij doen het wel, mogelijk een overblijfsel uit oude tijden maar misschien is er een andere reden de eerst volgende keer als weer een SDS-PAGE doe zal ik eens onze voorschriften nalopen.

#11

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 12 oktober 2007 - 08:31

Als bij anderen mensen de PAGE wel is gelukt dan denk ik toch echt dat je de polen hebt verwisseld. Je monster verliezen kan door diverse oorzaken komen, maar de marker moet altijd zichtbaar blijven en kan dus niet zomaar verdwijnen.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures