Springen naar inhoud

zilverkleuring


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Rik uit Arendonk

    Rik uit Arendonk


  • >25 berichten
  • 72 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 november 2007 - 16:07

Hallo iedereen

Ik ben bezig met een erg interessant project over het immuunsysteem van C. elegans. Ik gebruik hiervoor differentiele proteomics technieken. Deze week heb ik mijn eerste 2D gel gekleurd met zilver door braaf het protocol op te volgen en het is allemaal goed gelukt.
Nu, ik vind wel dat er erg veel reagentia gebruikt worden, waarvan het mij niet steeds duidelijk is wat hun precieze functie is. Het is onwaarschijnlijk dat de jury mij binnenkort gaat uitvragen over elk stapje uit mijn protocols, maar ik zou het gewoon graag weten.

In stap 1 worden de proteinen neergeslagen in 50% methanol en 5% azijnzuur. Ik vermoed dat het azijnzuur dient om aan te zuren, waardoor proteinen neerslaan en dat de methanol gebruikt wordt omdat de proteinen daar sowieso minder goed in oplossen. Is dit een volledige verklaring of vergeet ik iets?

In stap 2 wordt er gesensibiliseerd met natriumthiosulfaat. Ik weet dat het thiosulfaat-anion de overtollige zilverionen complexeert en dat het sulfide ion later een rol zal spelen bij de reductie: ik weet echter niet juist welke rol. Is dit een katalysator?

In stap 3 wordt er gekleurd met zilvernitraat. Wat ik hier niet goed begrijp is hoe het komt dat de zilverionen zich enkel in de buurt van de proteinen gaan bevinden, want later bij de ontwikkeling zal de reductie enkel daar doorgaan, of de neerslag zal zich althans enkel op proteinemateriaal bevinden.

In stap 4 wordt de gel 'ontwikkeld'. Er wordt natriumcarbonaat gebruikt. Is dat om de pH te doen stijgen en zo ja, waarom? Of is die NaCO3 echt een reagens?
Het eigenlijke reductans is formadehyde. Dit mag ik pas helemaal op het einde bij de natriumcarbonaat voegen. Is dit omdat het anders al zou gaan oxideren, of zou het neerslaan?
Hoe verloopt net de reactie tussen AgNO3 en CH2O? Zijn er nog eerder genoemde stoffen die effectief als reagens tussenkomen?

In stap 5 wordt de reactie stilgelegd door azijnzuur. Dit begrijp ik niet, hoe kan azijnzuur de reductie van de zilverionen stoppen?


Ik weet dat dit heel wat vraagjes zijn, maar ik heb m'n best al gedaan om te zeggen wat ik wel weet en tips en antwoorden zijn altijd welkom!

Groetjes
Rik

Veranderd door Rik uit Arendonk, 02 november 2007 - 16:07


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 november 2007 - 12:34

Electrophoresis. 1990 Oct;11(10):785-94
Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.
Rabilloud T.

Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 1994 Feb;40(1):57-75
Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview.
Rabilloud T, Vuillard L, Gilly C, Lawrence JJ.

http://www.nature.co...ot.2006.288.pdf

Hier vind je waarschijnlijk de meeste antwoorden op je vragen. Er zijn trouwens veel verschillende protocollen voor zilverkleuring in omloop.

sjouke

Veranderd door Hovinsj1, 05 november 2007 - 12:41






0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures