HPLC

poppetje_CF

hallo, wij hebben een methode ontwikkeld om de kleurstoffen van inkt, crystal violet en victorian blue, te identificeren.

Ik heb al veel dingen gelezen over de HPLC op het forum, maar de vragen die ik heb, zijn volgens mij nog niet eerder gesteld. Ik hoop dat jullie een antwoord hebben.

Er zijn 2 goede oplosmiddelen voor de kleurstoffen dit zijn acetontiril en methanol. De eerste is het beste, maar die is giftig dus hebben we methanol gebruikt.

We hebben dus de kleurstoffen verdund en opgelost in methanol en daarna hebben we de metingen uitgevoerd. HPLC met C18 kolom, uv detector, loopvloeistof 70:30 methanol water.

Eerst een domme vraag misschien. Wij injecteren maar 1 stof en we lossen het op. Is dit noodzakelijk? Moet je perse je stoffen oplossen voordat je het injecteert of kun je ook een stof gewoon injecteren?

Heeft dit oplosmiddel ook effect op de resultaten/metingen? Een andere groep lost de stoffen op in azijnzuur en volgens mij lijkt die stof een beetje op dat acetontiril, dus dat was misschien een beter oplosmiddel geweest. Kun je dus een betere scheiding/snellere elutie krijgen, omdat je een geschikter oplosmiddel hebt gebruikt?

Het is toch zo dat het mengsel wat je injecteert in de mobiele fase wordt opgelost en dan over de kolom wordt geleid?

Is het dan zo als het mengsel wat je injecteert echt heel goed oplost in de mobiele fase dat je scheiding dan beter wordt of betere resultaten krijgt dan een mengsel wat heel slecht in de mobiele fase oplost, of heeft dit er niks mee te maken. Dit gedeelte snap ik nog niet helemaal, ik hoop dat jullie snappen wat ik bedoel

Alvast bedankt voor de moeite

Napoleon1981

Er zijn 2 goede oplosmiddelen voor de kleurstoffen dit zijn acetontiril en methanol. De eerste is het beste, maar die is giftig dus hebben we methanol gebruikt.

Methanol is ook giftig

Eerst een domme vraag misschien. Wij injecteren maar 1 stof en we lossen het op. Is dit noodzakelijk? Moet je perse je stoffen oplossen voordat je het injecteert of kun je ook een stof gewoon injecteren?

Hoe ga je een vaste stof injecteren? Het scheidings mechanisme bij LC is de uitwisselen van analiet tussen de mobiele en stationaire fase. Dit is een diffusie, affiniteits principe. Denk je dat vaste stoffen een diffusie coefficent hebben?

Heeft dit oplosmiddel ook effect op de resultaten/metingen? Een andere groep lost de stoffen op in azijnzuur en volgens mij lijkt die stof een beetje op dat acetontiril, dus dat was misschien een beter oplosmiddel geweest. Kun je dus een betere scheiding/snellere elutie krijgen, omdat je een geschikter oplosmiddel hebt gebruikt?

Het oplosmiddel en pH hebben een grote invloed op de scheiding. Acetonitrile is een compleet andere stof dan azijnzuur. Azijnzuur is namelijk protisch.

poppetje_CF

Was bekend dat methanol ook giftig was, maar minder dan die eerste, maar dat maakt ook niet uit.

Sorry voor die tweede vraag, echt heel domme vraag. Ik heb die vaste stoffen zelf afgewogen en opgelost dus dat is beetje kansloze vraag.

Dit is de eerste module chromatografie die we hebben dus veel kennis erover hebben we (nog) niet. Ik weet niet wat protisch is en daar hoeven wij bij dit project ook nog helemaal geen rekening mee te houden. Ik had eigenlijk een wat meer oppervlakkig antwoord verwacht.

Op wikepedia wordt gezegd dat acetonitril vergelijkbaar is met azijn zuur. Ik weet dat een andere groep die stoffen in azijnzuur heeft opgelost dus dat zal wel om deze reden zijn. Nogmaals wij zijn nog een beetje met de basis bezig dus met al die details hebben we nog niks te maken.

We moeten onderzoeken met welke pen een geschreven tekst is geschrven. Dus wij hebben kalibratielijnen gemaakt met de HPLC voor die kleurstoffen. Daarna hebben wij de concentraties, van de kleurstoffen bepaald in de pennen en de tekst om een antwoord te krijgen. Zo simpel eigenlijk voor jullie, maar ik ben nogmaar een beginner. Wij hebben gewoon een aantal dingen gedaan om gewoon goede gescheiden pieken te krijgen, waardoor we een goede kalibratielijn hebben kunnen maken. Dit is gewoon nog meer dingen uitproberen en kijken wat er gebeurt.

Napoleon1981

Op de engelse wikipedia wordt het vergeleken met aceton, een veel betere vergelijking. Op de nederlandse versie kan ik het niet vinden. Heb je een link?

Dit is de eerste module chromatografie die we hebben dus veel kennis erover hebben we (nog) niet. Ik weet niet wat protisch is en daar hoeven wij bij dit project ook nog helemaal geen rekening mee te houden. Ik had eigenlijk een wat meer oppervlakkig antwoord verwacht.

Je stelt een vraag maar niet altijd is daar een simpel of oppervlakkig antwoord op te geven. Het hangt allemaal van je analiet en solvent interacties af. Protisch is de mogelijk tot waterstof brug vorming. Hexaan is bijvoorbeeld aprotisch, hexanol daar en tegen is protisch. Dat je bij je project hier geen rekening mee hoeft te houden is natuurlijk je kop in het zand steken. Deze factoren spelen mee en je zult experimenteel tegen de effecten van deze factoren aan lopen. Ook als je er niet over praten wilt of hoeft van je docent.

bteunissen

Op wikepedia wordt gezegd dat acetonitril vergelijkbaar is met azijn zuur. Ik weet dat een andere groep die stoffen in azijnzuur heeft opgelost dus dat zal wel om deze reden zijn. Nogmaals wij zijn nog een beetje met de basis bezig dus met al die details hebben we nog niks te maken.

Als je net begint met chromatografie en je werkt zoals jullie met simpele scheidingen om wat gevoel te krijgen voor het werken met een HPLC dan is het oplosmiddel voor je analiet (de kleurstof) niet zo belangrijk als je loopvloeistof ( zolang de stof maar oplost). Die andere groep die de stof in azijnzuur heeft opgelost moet daarnaast ook nog methanol of bijv. acetonitril gebruikt hebben als loopvloeistof. Op een HPLC C18 kolom gebruik je geen loopvloeistof van 100% water en ook geen water met azijnzuur. Je gebruikt een mengsel van een anorganisch (bijv water) en een organisch (bijv MeOH of ACN) oplosmiddel. De reden om daar dan nog azijnzuur aan toe te voegen is voornamelijk om de pH van de oplossing aan te passen. Zoals Napoleon1981 al zei: de pH is heel erg belangrijk bij een HPLC scheiding.

Het verschil tussen methanol en acetonitril bij een scheiding is voornamelijk het feit dat stoffen met acetonitril sneller/makkelijker van de kolom af elueren. Acetonitril is zogezegd een sterker organisch eluens dan methanol. Je kan het proberen: als je de HPLC scheiding tussen de kleurstoffen geoptimaliseerd hebt, dus je hebt een mooie scheiding. Probeer dan eens de methanol om te wisselen voor acetonitril waarbij je voor de rest alle parameters gelijk houdt. Kijk dan eens naar de invloed op de scheiding en de snelheid waarmee de stoffen van de kolom af komen (de retentietijd).

We moeten onderzoeken met welke pen een geschreven tekst is geschreven. Dus wij hebben kalibratielijnen gemaakt met de HPLC voor die kleurstoffen. Daarna hebben wij de concentraties, van de kleurstoffen bepaald in de pennen en de tekst om een antwoord te krijgen. Zo simpel eigenlijk voor jullie, maar ik ben nogmaar een beginner. Wij hebben gewoon een aantal dingen gedaan om gewoon goede gescheiden pieken te krijgen, waardoor we een goede kalibratielijn hebben kunnen maken. Dit is gewoon nog meer dingen uitproberen en kijken wat er gebeurt.

Betekent dit dat je de HPLC methode al af hebt en de scheiding tussen de kleurstoffen al geoptimaliseerd is?

Succes,

Bas

poppetje_CF

We krijgen een bepaalde tijd om zo'n project uit te voeren. Deze is al helemaal uitgevoerd en het verslag is al ingeleverd. Alleen krijgen we volgende week ofzo een gesprek erover waarin je allemaal vragen kan verwachten dat project, zodat zij kunnen kijken of je echt weet wat je gedaan hebt of geleerd.

Ik wil hier gewoon graag goed op voorbereid zijn, helemaal omdat ik het een moeilijk ondewerp vind. Dus wat jij net voor opties noemde (die in het laatste bericht) dat kunnen best wel eens de vragen zijn.

WE hebben geen goede resultaten behaald en ook niet genoeg tijd gehad om het te optimaliseren.

Ik heb een tijdje hier op het forum gelezen en jullie zijn allemaal hartstikke slim en leggen ook nog redelijk begrijpelijk uit. Dus daarom hoop ik dat jullie mij wat dingen kunnen vertellen, zodat ik het allemaal wat beter begrijp en weet wat we de volgende keer beter kunnen doen.

Wij hebben methanol als oplosmiddel gebruikt, alleen omdat deze 1 van de beste oplosmiddelen was. Dat acetonitril was de beste, maar we hebben voor methanol gekozen omdat die ook veel aanwezig was. We hebben methanol/water gebruikt omdat die stoffen waren aangesloten en we hebben daar eigenlijk niet verder bij nagedacht. En de begeleider heeft daar verder ook niks over gezegd.

Nou zijn wij erachter gekomen dat een ander groepje dan oplost in azijnzuur en dat hebben ze te horen gekregen van een leraar en ik vraag me dan af waarom? Wat is het verschil tussen het analiet oplossen in azijnzuur of methanol?? Hebben zij hier door betere resultagen en waarom? of maakt het eigenlijk niet zoveel uit.

Ik dacht dat ik had gezien dat bij hun HPLC een fles azinjzuur was aangesloten en dat ze dat ook als eluens hebben gebruikt (dit weet ik niet zeker hoor) En zo ja wat voor verschillen in je meting krijg je dan als je methanol/water of azijnzuur/water gebruikt?

De eerste meting die we hebben uitgevoerd was vet vaag, want we hadden verdunningen gemaakt van die kleurstoffen. bij de 8000x verdunning kregen we een grotere piekoppervlakte en bij de 2000x verdunning een kleinere? Dit klopt dus niet en niemand die daar een normaal antwoord op kan geven wat hier verkeerd is gegaan, misschien jullie een idee?

We injecteren steeds maar 1 kleurstof en een paar keer kregen we gewoon een hele slechte gescheiden piek, wat eigenlijk drie pieken waren. Hoe kan dit precies?

Ik zit op een zwaar overbezette school. Missschien wel bekend dat er weinig tijd is voor een project, niet altijd de apparatuur beschikbaar of begeleiders. Dus we hebben onze methode lang niet genoeg kunnen optimaliseren. Ik denk dat we daar wel vragen over krijgen van wat kunnen jullie de volgende keer anders of beter doen en wat zijn daar de uitkomsten van. Ik snap het allemaal wel redelijk, maar niet helemaal tot in de details en ik wil er gewoon wat meer over weten zodat ik goed voorbereid ben en het voor een volgende keer weet.

Als de verhoudingen van methanol/water verandert dus bijvoorbeeld 80:20 of 90:10 is dit alleen voor een snellere elutie of kun je hierdoor ook een betere scheiding krijgen van de storende matrix?

Een gradient wordt vaak toegepast bij meerdere stoffen met een verschillende karakter. Het andere groepje heeft deze wel gedaan, wij hebben daar geen tijd voor gehad. Is het bij deze methode, omdat we maar 1 stof analyseren, ook goed toepasbaar?

Wij kregen steeds een piek op de retentietijd van 7.5 min. Betekent dit dat het mengsel van 1 kleurstof met methanol dus meer apolair is??

Verder heeft napoleon het over dat protische gedoe. Daar hebben wij nooit over gedacht en hier is ook nooit wat over gezegd door leraren dus dat is bij ons niet van toepassing geweest. Het zal dan wel belangrijk zijn, maar voor ons nu nog niet.

Een heel lang verhaal, maar ik hoop dat jullie wat tips kunnen geven of wat dingen extra kunnen uitleggen? Alvast bedankt voor de moeite

Napoleon1981

Verder heeft napoleon het over dat protische gedoe. Daar hebben wij nooit over gedacht en hier is ook nooit wat over gezegd door leraren dus dat is bij ons niet van toepassing geweest. Het zal dan wel belangrijk zijn, maar voor ons nu nog niet.

Ik probeer antwoord op je vraag te geven. 8-[ . En het is bij jou van toepassing en kan trouwens ook nog wel eens het antwoord zijn op je verdunning gebeuren. Maargoed als je mijn antwoorden niet hebben wilt of niet de moeite neemt om 1 stapje verder te denken en misschien ook nog wat te leren..... dan houdt het op voor mij.

Suc6

poppetje_CF

Napoleon1981 schreef:

Ik probeer antwoord op je vraag te geven. 8-[ . En het is bij jou van toepassing en kan trouwens ook nog wel eens het antwoord zijn op je verdunning gebeuren. Maargoed als je mijn antwoorden niet hebben wilt of niet de moeite neemt om 1 stapje verder te denken en misschien ook nog wat te leren..... dan houdt het op voor mij.

Suc6

Ik probeer antwoord op je vraag te geven. . En het is bij jou van toepassing en kan trouwens ook nog wel eens het antwoord zijn op je verdunning gebeuren. Maargoed als je mijn antwoorden niet hebben wilt of niet de moeite neemt om 1 stapje verder te denken en misschien ook nog wat te leren..... dan houdt het op voor mij.

Suc6

Tuurlijk wil ik wel verder kijken dan mn neus lang is en ik wil ook heel graag wat meer hierover leren, maar ik weet gewoon niet waar je heen wilt??

Je zult wel gelijk hebben dat PH belangrijk is voor je scheiding, want je bent veel slimmer dan ik, maar ik vind het gewoon vaag als dit zo belangrijk is waarom geen 1 leraar of begeleider het hierover heeft gehad bij ons?

Misschien als je wat meer hierover wilt uitleggen dat het lampje dan gaat branden, want ik snap niet goed waar je heen wilt? alvast bedankt

bteunissen

Een protische stof is een stof die een functionele groep heeft die protonen(waterstof atomen) kan opnemen en afstaan. Als je met dit soort stoffen te maken hebt dan is de pH van de omgeving waarin je meet (in dit geval het eluens van je HPLC) extra belangrijk. Dit is omdat de pH bepaalt of je molecuul geprotoneerd is of niet en dat bepaalt weer of je te maken hebt met een molecuul dat een lading heeft of juist neutraal is.

Als je molecuul een lading heeft dan is er weinig interactie met de C18 groepen op je HPLC kolom en is er dus weinig retentie. Als je molecuul neutraal is (dus niet geladen) dan vindt er meer interactie plaats met de C18 in je HPLC kolom en is er dus ook meer retentie.

Je zal nu dus misschien wel begrijpen waarom het belangrijk is wat de pH van je eluens is bij HPLC scheidingen.

poppetje_CF

Ik snap het wel een beetje, maar deze theorie komt me niet bekend voor. We hebben hier ook absoluut geen rekening mee gehouden.

Napoleon1981

Ok onthoudt gewoon dat oplosmiddel en pH een grote invloed hebben op een scheiding. Dit is het antwoord op deze vraag:

Heeft dit oplosmiddel ook effect op de resultaten/metingen? Een andere groep lost de stoffen op in azijnzuur en volgens mij lijkt die stof een beetje op dat acetontiril, dus dat was misschien een beter oplosmiddel geweest. Kun je dus een betere scheiding/snellere elutie krijgen, omdat je een geschikter oplosmiddel hebt gebruikt?

Het is toch zo dat het mengsel wat je injecteert in de mobiele fase wordt opgelost en dan over de kolom wordt geleid?

Is het dan zo als het mengsel wat je injecteert echt heel goed oplost in de mobiele fase dat je scheiding dan beter wordt of betere resultaten krijgt dan een mengsel wat heel slecht in de mobiele fase oplost, of heeft dit er niks mee te maken. Dit gedeelte snap ik nog niet helemaal, ik hoop dat jullie snappen wat ik bedoel

Ok alles is natuurlijk opgelost wanneer je injecteerd. Het gene waar jij op doelt is affiniteit. Waneer een stof beter oplost, heeft het een grotere affiniteit met de vloeistof. In HPLC gebruik je vaak een apolaire kolom en een polaire mobiele fase. Wanneer je te analyseren stof dus polair is, heeft het meer affiniteit voor de mobiele fase dan voor de apolaire kolom. Resultaat is dus dat het sneller door je kolom heen stroomt.

Dus door je mobiele fase te veranderen kun je het evenwicht verleggen.

poppetje_CF

Ok onthoudt gewoon dat oplosmiddel en pH een grote invloed hebben op een scheiding. Dit is het antwoord op deze vraag:

Dat zal ik zeker doen.

Dus door je mobiele fase te veranderen kun je het evenwicht verleggen.

Berust de scheiding dan echt alleen maar op polariteit? Want water en methanol zijn toch allebei heel erg polair. Hoe kun je hier dan een goede gradient elutie mee uitvoeren, want je mobiele fase blijft erg polair?

Bteunissen heeft het over dat acetonitril een "sterker organisch oplosmiddel" is en dat je daardoor een snellere elutie kunt krijgen. Als je de verhouding methanol/water gaat verhogen van 70:30 naar 80:20 heb je ook een snellere elutie dacht ik. Dan heb je ook meer organische stof. Komt dit dan alleen omdat de mobiele fase minder polair wordt of hebben er nog andere dingen mee te maken. Waar is het op gebaseerd? Heeft dat iets te maken met de elutie sterkte uitgedrukt in dat rare E-tje?

Fuzzwood

Napoleon1981 schreef: Ok onthoudt gewoon dat oplosmiddel en pH een grote invloed hebben op een scheiding. Dit is het antwoord op deze vraag:
Dat zal ik zeker doen.

Dus door je mobiele fase te veranderen kun je het evenwicht verleggen.
Berust de scheiding dan echt alleen maar op polariteit? Want water en methanol zijn toch allebei heel erg polair. Hoe kun je hier dan een goede gradient elutie mee uitvoeren, want je mobiele fase blijft erg polair?

Bteunissen heeft het over dat acetonitril een "sterker organisch oplosmiddel" is en dat je daardoor een snellere elutie kunt krijgen. Als je de verhouding methanol/water gaat verhogen van 70:30 naar 80:20 heb je ook een snellere elutie dacht ik. Dan heb je ook meer organische stof. Komt dit dan alleen omdat de mobiele fase minder polair wordt of hebben er nog andere dingen mee te maken. Waar is het op gebaseerd? Heeft dat iets te maken met de elutie sterkte uitgedrukt in dat rare E-tje?

Je stationaire fase is dus apolair. Heb je een redelijk apolair analiet, dan zal deze vaker aan de stationaire fase blijven plakken. Soort zoekt soort

Napoleon1981

poppetje schreef: Berust de scheiding dan echt alleen maar op polariteit? Want water en methanol zijn toch allebei heel erg polair. Hoe kun je hier dan een goede gradient elutie mee uitvoeren, want je mobiele fase blijft erg polair?

Het hangt van je type kolom af. Bij een C18 kolom ja. Als je een ionexchange kolom gebruikt niet. Dan doe je chromatografie op elektrostatische interacties.

Water is heel erg polair. Methanol of acetonitriel een stuk minder, dus door de organische stof te verhogen verhoog je de kans dat een analiet zich in de mobiele fase bevindt en dus elueert. Zoals fswd al zegt, soort zoekt soort.

Dan heb je ook meer organische stof. Komt dit dan alleen omdat de mobiele fase minder polair wordt of hebben er nog andere dingen mee te maken. Waar is het op gebaseerd? Heeft dat iets te maken met de elutie sterkte uitgedrukt in dat rare E-tje?

Precies.

Trouwens bij lage concentraties methanol, is methanol sterker dan acetonitriel. Pas bij hogere concentraties 80% organisch wordt acetonitriel echt sterker dan methanol.

poppetje_CF

Deze theorie kende ik wel al een beetje. Bteunissen benadrukte in een eerder bericht dat je een organisch en anorganische stof gebruikt bij HPLC en daardoor kreeg ik een beetje het idee dat je misschien een organische stof nodig hebt voor bepaalde eigenschappen waardoor je een betere scheiding krijgt ofzo. Maar het is dus alleen maar op polariteit gebaseerd.

Trouwens bij lage concentraties methanol, is methanol sterker dan acetonitriel. Pas bij hogere concentraties 80% organisch wordt acetonitriel echt sterker dan methanol.

Ja dat heb ik gezien in een topic hier op het forum. Daarin stond een link naar een grafiek waarin je kon zien dat methanol sterker is bij lagere concentraties.

Bedankt voor de info

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

HPLC

HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC

Re: HPLC