Springen naar inhoud

Eiwit bradford bepaling


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Bioshock

    Bioshock


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 16:22

Hey,

We gebruiken een eiwit bradford methode om lage concentraties eiwit te bepalen. Concentratiereeks is 1 tot 10 Ķg/ml. Het probleem is dat we ook een 0,5% fenol in het medium hebben zitten dat erg stoort met de analyse. Deze moet aan de ijkreeks worden toegevoegd omdat de samples die gemeten moeten worden deze fenol ook bevat. Precipitatie is niet aan te raden omdat we met een te lage concentratiereeks werken.

Iemand nog een goede suggestie voor een alternatieve methode?

Alvast bedankt.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 18 februari 2008 - 16:55

Kan een blanco met 0,5 % fenol het probleem niet grotendeels verhelpen?

#3

RubenM

    RubenM


  • >250 berichten
  • 336 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 16:58

Voorzover ik weet is 0,5% fenol juist de concentratie die de beste resultaten geeft (verbetering gevoeligheid/lineariteit) in een Bradfordbepaling, maar dat is redelijk eiwitafhankelijk. Gangbare eiwitten zouden weinig storing moeten ondervinden en eerder moeten opknappen van 0,5% fenol. Kijk je naar een specifiek eiwit of naar totaal-eiwit? Ik zou een calibratie-eiwit gebruiken dat in AZ-samenstelling het eiwit waarin je geÔnteresseerd bent redelijk benadert. Verder kom ik niet zomaar op een alternatief. Je sluit zelf acetonbehandeling al uit, en de gangbare andere eiwitassays zijn veel vatbaarder voor fenol-interferentie. Er zijn hoogstens wat berekeningsmodellen bekend die je los kunt laten op je resultaten. Als je online toegang tot tijdschriften hebt kun je eens kijken in

Analytical Biochemistry 346 (2005) 43-48

#4

Bioshock

    Bioshock


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 19:19

Bedankt voor de reactie,

Wij gebruiken in onze blanco ook 0,5% fenol. En de bradford assay is opgezet om totaal eiwit gehalte te meten. Fenol heeft blijkbaar invloed op het bradford reagens, waarschijnlijk komt dit door de OH groep in fenol? OH groepen stimuleert toch de coomassie rood naar coomassie blauw? Dit zou theoretisch moeten storen met de kleine concentratie eiwit? Ik heb ook in een artikel gelezen dat de toevoeging van fenol juist de bradford assay ten goede komt, ik snap alleen niet hoe.

Bovendien zie ik vaak na toevoeging van reagens blauwe 'slierterige' neerslag, kan het zijn dat coomassie moleculen met elkaar neerslaan. Of is dit de fenol die met coomassie neerslaat?

Als eiwit reeks gebruiken we BSA, misschien is hier nog een beter alternatief voor.

Gr.

#5

RubenM

    RubenM


  • >250 berichten
  • 336 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 19:49

Fenol heeft twee eigenschappen: het is zuur (maar dat is niet boeiend, omdat Bradfordreagens sowieso wat zuur is), en het kan dmv fysisorptie ook aan je Coomassie gaan hangen.

Misschien dat je je fenol kunt complexeren met polyvinylpyrrolidon (een paar mg per mL)...

Zie je verschil tussen een BSA-calibratierijtje met 0.5% fenol + Coomassie en een calibratierijtje zonder 0.5% fenol + Commassie?

#6

Bioshock

    Bioshock


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 18 februari 2008 - 22:14

Ik heb verschillende concentraties fenol getest, 0,1% 0,2% 0,3% en 0,4%. Wat duidelijk werd is dat de absorbance van de hogere standaarden ook en de helling hoger wordt waardoor betere correlatiecoefficient verkregen wordt.

Wat is het voordeel van complexeren met polyvinylpyrrolidon? krijg je dan neerlsag wat af te draaien is?

Veranderd door Bioshock, 18 februari 2008 - 22:23


#7

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 18 februari 2008 - 22:24

Misschien een domme vraag: je maakt je ijklijn toch wel met medium?

mijn apparaat is kapot :x barst de stekker zit er niet in :oops:





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures