Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Xochipilli

Tijdens het labo biochemie op school moest ik een kwantitatieve bepaling doen van eiwitten met de biureetmethode.

Ik heb dus mijn biureet reagens bereid door 0,75 g CuSO₄^.H₂O en 2,25 g Na-K-Tartraat op te lossen in 125 ml NaOH (O,2 M), hieraan heb ik 1,25 g KI toegevoegd en aangelengd tot 250 ml met terug 0,2 M NaOH.

Ik heb een stockoplossing van 20 mg/ml albumine bereid en hieruit 10 verschillende concentraties gemaakt voor een ijklijn op te stellen, namelijk 0,5; 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20 mg/ml.

Aan elke 1ml Eiwitoplossing en blanco heb ik 1,5 ml biureetreagens toegevoegd.

Deze heb ik goed gemengt en laten incuberen voor 10 min bij 37 °C (al schuddend), en daarna even laten afkoelen.

Daarna heb ik met de UV/VIS spectrofotometer de absorbantie gemeten van elke oplossing bij 540 nm t.o.v. de blanco. Met de blanco heb ik ook voor de metingen een autozero correctie doorgevoord tegenover een identieke blanco oplossing.

Ik heb dus het standaard recept gevolgd voor de biureetmethode.

Maar Nu,

Mijn ijklijn heeft een correlatie coëfficient van 0,994 tot de concentratie van 10 mg/ml, welke voldoende is voor de normen van onze leerkracht.

Maar na de concentratie van 10 mg/ml en bij een absorbantie van 1,0 gaat de curve ineens sterk afbuigen en gaat een golfvorm vertonen tot 20 mg/ml, en dus niet meer stijgen, maar ongeveer gelijk blijven tussen een absorbantie van 1,0 en 1,2.

Ik heb de meting natuurlijk nog eens uitgevoerd de week erachter met een nieuw bereide stockoplossing en verdunningsreeks voor mijn ijklijn, maar ik kom bijna exact hetzelfde resultaat uit.

Heb ik een limiet bereikt in de kleuring door biureet bij een concentratie van 10 mg/ml albumine?

Ik dacht eerst dat de spectrofotometer eerst niet ingesteld was voor een absorbantie hoger dan 1,0, maar ik heb bij een meting van een sterk geconcentreerd eiwitstaal bereid volgens de biureetmethode een absorbantie gemeten van 1,9.

Weet er iemand wat de verklaring hiervoor zou zijn?

Gerard

Ik denk dat je gelijk hebt dat de biureetmethode niet zo hoog kan meten, vroeger toen we de biureetmethode gebruikten voor de eiwitbepaling in serum gebruikten we 100 ul serum in 4 ml biureet en hadden een meetbereik van 20 tot 140 g/l.

Ik weet niet wat de factor was die bovengrans bepaalde, het kan de volledige capaciteit van het reagens zijn maar ik acht het niet onmogelijk dat door de hoge eiwitconcentratie de meting ook fout kan gaan.

Er staat me iets van bij dat we op een zeker moment ook een blancoreagens gebruikten van biureet zonder kopersulfaat om dit te compensren.

Maar ja het is zo'n 25 jaar geleden en het geheugen is niet altijd betrouwbaar.

Napoleon1981

Sterk geconcentreerd is? 1000x zoveel? Als je dan maar een 0.9 verhoging krijgt is het nog steeds niet lineair en mis je het je albumine.

Je hebt het lineaire berijk van je methode bepaald en lijkt me aanvaardbaar. Waarschijnlijk is de detector niet lineair meer, ik denk niet dat de chemie opeens problemen gaat veroorzaken. Je kunt je monsters natuurlijk altijd op de ijklijn verdunnen.

Een check. Verdun eens de oplossing van 15mg/ml 1:1 en kijk dan of je de zelfde absorbantie vindt als een 7.5 monster.

DrQuico

Voor een kwantitatieve spectrofotometrische bepaling moet je ervoor zorgen dat zowel je ijklijn als je analyt een absorptie tussen 0.1 en 0.9 heeft. Hierbuiten neemt de afwijking sterk toe en kan de wet van Lambert-Beer niet meer gebruikt worden voor een nauwkeurige bepaling.

Wanneer je, zoals napoleon1981 al suggereert alles met een factor 2 verdunt dan kom je prima uit voor zowel je ijklijn als je analyt.

Xochipilli

Ok bedankt allemaal, ik had op voorrand al verschillende verdunningsconcentraties gemaakt van mijn onbekende eiwitoplossing zodat er zeker 1 overeenkwam met de ijklijn. Dus daar zit ik safe.

Ik ga mijn ijklijn denk ik niet nog eens tweemaal verdunnen, 0,5 mg/ml is normaal gezien ook de laagst detecteerbare concentratie (zonder afwijkingen) bij de biureetmethode.

Ik ga hem gewoon afsnijden bij 10 mg/ml, aangezien ik tot daar toch een correlatiecoëfficiënt heb van 0,994 wat genoeg moet zijn naar onze normen op school.

Wetenschapsforum

Laatste berichten

Nieuwsberichten

Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Re: Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Re: Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Re: Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten

Re: Probleem bij kwantitatieve bepaling eiwitten