Springen naar inhoud

transfectie van miRNA's


  • Log in om te kunnen reageren

#1

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 maart 2008 - 14:59

Wanneer ik miRNA's wil transfecteren in een cel. Hoe kan ik dan waarnemen of de cel deze miRNA's wel degelijk heeft opgenomen?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 maart 2008 - 17:34

Je moet controles gebruiken, zoals GFP-NLS (kern van positieve cellen wordt groen) of een stabiele lijn maken.

#3

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 maart 2008 - 09:29

Dus ik moet ook een eiwit maken die GFP is en een NLS heeft? Maar dan kan het toch zijn dat de ene cel dit heeft opgenomen en geen miRNA en dat de kern toch groen kleurt?

Hoe maak je een stabiele cellijn?

Zou het ook gaan door een plasmide te gebruiken waar een GFP mRNA op ligt die de complementaire sequentie van het miRNA bezit. Wanneer de cel enkel het plasmide heeft opgenomen wordt ze groen. Als die cel het plasmide en het miRNA heeft opgenomen zal het groen verdwijnen aangezien het miRNA nu kan interageren met dat mRNA van GFP. Of is dit niet haalbaar?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#4

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 maart 2008 - 18:17

Stabiele cellijnen maak je met behulp van een selectie, dit in in principe hetzelfde als antibiotica resistentie markers bij bacteriŽle transformaties. G418 (Geneticin) is een veel gebruikte selectie. Het resistentie gen moet natuurlijk wel op je plasmide liggen.

Een mooi systeem is de IRES (internal ribosomal entry site) GFP vector.
Je gen van interesse (in dit geval dus je miRNA) kloneer je in deze vector. Zodra je de vector tranformeerd, krijg je twee RNA transcripten: je miRNA en GFP-NLS mRNA. Deze twee mRNA zijn ongeveer in dezelfde hoeveelheid aanwezig: maw je GFP intensiteit is evenredig aan je translatie van je miRNA. Dit is dus niet alleen een marker voor positive cellen, maar je kan hiermee ook verschillende constructen met elkaar vergelijken, door cellen te selecteren die een gelijke GFP expressie hebben.

De IRES vector in volgens mij van invitrogen, dus op die website kun je nog verdere informatie vinden.

#5

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 maart 2008 - 21:53

Stel ik ken de plaats niet in het genoom waar het miRNA zich bevind. Ik heb dus enkel het mature miRNA ter beschikking.
Kan ik dan het volgende doen?:
-mature miRNA
-plasmide met GFP die specifieke sequentie bevat waar het miRNA mee kan binden

Maar hoe weet ik dan dat mijn transfectie goed gelukt is. Mijn cel kan namelijk het plasmide opgenomen hebben maar niet het miRNA en dus geen verandering van GFP vertonen. Maar het kan even goed zijn dat mijn cel geen verandering van GFP vertoont en toch het miRNA bevat, maar dat dan blijkbaar niet interageert met de target. Hoe kan ik dit achterhalen?

ohja en ik bedenk me juist iets: hoe kan een plasmide in hemelsnaam aanleiding geven tot mRNA in een humane levercel, waar de DNA polymerase ed voor de transcriptie zich in de kern bevinden?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#6

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 26 maart 2008 - 11:59

Ik zou deze site even doorlezen, dit bedrijf is gespecialiseerd in het tools voor miRNA onderzoek.
http://www.dharmacon...na/default.aspx

De plasmide komt vanzelf in de kern terecht, doordat er op de plasmide eukaryotische promoters liggen voor je gen van interesse, bijvoorbeeld de HCMV promoter, komt je eiwit tot expressie in cellen, maar niet in bacteriŽn, het amp. resistentie gen ligt weer achter een andere promotor, die specifiek is voor bacteriŽn. Je kan natuurlijk ook je eigen promoter ervoor zetten, door de +/- 2000 bp voor je gen erbij te kloneren.

Veranderd door Roy van Heesbeen, 26 maart 2008 - 12:53






0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures