Springen naar inhoud

gelelektroforese


  • Log in om te kunnen reageren

#1

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 maart 2008 - 16:22

Hallo allen,

Ik had de volgende vragen:

wanneer je werkt met een niet denaturerend buffersysteem dan betekent dit toch dat je je eiwitten niet gaat denatureren ?
Zoja, waarom zegt men dan dat een ureum buffersysteem niet denaturerend is? Ureum gaat toch ook eiwitten denatureren?
(of is dit een fout in mijn cursus? en is ureum wel een denaturerend buffersysteem?)


Verder wordt er in mijn cursus het gebruik van een stackinggel besproken. Er staat een tekening in mijn cursus waar die stackinggel gans vanboven getekend is, maar nu vroeg ik mij af: als deze stackinggel vaboven gelegen is (net onder het buffersysteem aan de bovenkant) dan kan je toch geen goede scheiding verkrijgen op basis van lading? Want stel dat de negatieve lading vanboven wordt aangebracht dan ga je toch een zeer slechte scheiding krijgen van de positief geladen eiwitten aangezien de stackinggel gans vanboven getekend staat?)


Dus met andere woorden: zo'n stackingel, wordt deze niet in het midden aangebracht op zo'n discontinu electroforese systeem?

Of wat ook kan: wordt zo'n stacking gel alleen gebruikt wanneer je werkt met een buffersysteem dat je eiwitten een bepaalde lading geeft, zodat ze toch altijd weg migreren uit de stacking gel? (en dus enkel scheiding op basis van grootte plaatsvindt)

alvast bedankt

Veranderd door lucilius, 28 maart 2008 - 16:35


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 28 maart 2008 - 16:36

Bij een denaturerend systeem wordt er door sds voor gezorgt dat elk eiwit een negatieve lading krijgt waardoor de scheiding geschiedt op MW.
Een stacking gel heeft als funktie de eiwitten geconcentreerd in een enkele band op de scheidingsgel te brengen.

#3

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 maart 2008 - 16:40

Gerard, ik begrijp waarom je een stackingel gebruikt, alleen snap ik niet dat die stackinggel vanboven , vlak onder een buffer, gezet wordt wanneer je eventueel zou scheiden op basis van lading.


Of wordt zo'n stackinggel enkel toegepast wanneer je enkel scheidt op basis van grootte? (alle eiwitten dus dezelfde lading en gedenatureerd) Met andere woorden: zo'n stackinggel kan enkel gebruikt worden bij gedenatureerde eiwitten?

Veranderd door lucilius, 28 maart 2008 - 16:41


#4

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 28 maart 2008 - 17:22

De stackinggel heeft relatief erg grootte porieen tov de scheidingsgel waardoor de eiwitten op het grensvlak ineens een grotere weerstand ondervinden en de de achterlopende eiwitten hun voorgangers inhalen en gelijktijdig op de scheidingsgel terechtkomen. Dit staat verder los van wel of niet gedenatureerd eiwit.

#5

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 maart 2008 - 10:53

Hallo gerard.

Akkoord, ik ben volledig mee met je en begrijp dat.

Helaas is dat niet wat ik mij afvraag.


Ik heb een tekening van zo'n opstelling waarbij men een stackinggel gebruikt, deze stackinggel wordt gans vanboven gezet op de running gel.

Aan de bovenkant zit een buffersysteem en aan de onderkant zit een buffersysteem.

Aan de onderkant zit de positieve pool en aan de bovenkant de negatieve pool.

Wanneer je werkt met gedenatureerde eiwitten die allemaal negatief gelaten zijn, dan maakt het niet uit dat de stackinggel vanboven geplaatst is: al de eiwitten zullen toch naar beneden migreren.
Maar wanneer je werkt met eiwitten die nog wel hun lading hebben en dus sommige positief geladen, dan zullen deze positief geladen eiwitten toch naar de negatieve pool migreren met andere woorden naar het bovenste buffersysteem en dit buffersysteem bevindt zich vlak boven de stackinggel !

Snap je nu wat ik bedoel?
Als je zo'n stackinggel gebruikt, dan kan je toch geen goed onderscheid hebben op basis van ladingsgrootte als je de stackinggel vlak onder een buffersysteem zet?



Om het misschien eenvoudiger te maken: stel je voor dat je met sds werkt en al de eiwitten hebben een negatieve lading en je zet je stackinggel net onder de buffer die positief geladen is.... (snap je mijn punt dan.... ==> alle eiwitten zullen gewoon vanuit de stackinggel naar het buffersysteem met de positieve lading lopen als vlak onder het buffersysteem de stackinggel zit...)

#6

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 maart 2008 - 15:54

Ik kan je zo niet volgen misschien dat het plaatje kunt posten.
Een sample breng je boven op de stacking gel zodat het er altijd doorheen naar de scheidingsgel gaat want ander heeft het geen zin.

#7

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 maart 2008 - 16:28

Ik kan je zo niet volgen misschien dat het plaatje kunt posten.
Een sample breng je boven op de stacking gel zodat het er altijd doorheen naar de scheidingsgel gaat want ander heeft het geen zin.

zie het bijgevoegde plaatje.

Geplaatste afbeelding

Stel nu dat je dus op die stackinggel een eiwitstaal doet en je weet dat de bovenste buffer + geladen is en de onderste - geladen.
Dan ga je toch nooit een goede scheiding krijgen van je eiwit op basis van lading? (toch maar enkel op basis van grootte?)

Je krijgt die scheiding niet omdat je staal op de stackinggel gedaan wordt en deze stackinggel bevindt zich vlak onder de bovenste buffer (+) met andere woorden al de negatief geladen eiwitten in je staal zouden naar boven toe gaan migreren.


Dus met andere woorden: moet zo'n stackinggel niet meer in het midden gedaan worden wanneer je ook wil scheiden op basis van ladingen? Of wordt zo'n stackinggel niet gebruikt wanneer je op basis van ladingen scheidt?

#8

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 maart 2008 - 17:36

Sorry ik had de vraag verkeerd geinterpreteerd.
SDS-Page is een techniek die altijd scheidt op grootte doordat de SDS de hegere structuren van de eiwitten afbreekt tot liniaire en een negatieve lading geeft aan alle eiwitten.
Denaturatie geschiedt door het verbreken van de sulfidebruggen waardoor de de di-, tri-, ... worden gesplitst in monomeren die ook door SDS negatief geladen worden.

#9

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 maart 2008 - 17:43

Ok.

Met andere woorden: zo'n stackinggel wordt niet gebruikt wanneer je je eiwitten niet denatureert?
(dus wanneer je scheiding wil op basis van grootte en lading ga je geen stackinggel gebruiken?)

Of: je gaat enkel met een stackinggel werken als je met sds werkt?


Jij spreekt altijd over sds, maar je hebt toch nog andere technieken ook?

#10

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 maart 2008 - 17:51

Er zijn vele uitvoeringen van elektroforese scheidingen (isoelektrofocussing,high resolution elektroforese, immunoelektroforese, 2D, horizontaal, vertikaal enz)

Zover ik weet wordt alleen bij SDS-Page een stackinggel gebruikt maar hier kan ik het mishebben want ik heb lang niet alle technieken gebruikt.

Je hoeft geen stacking gel te gebruiken maar dan is de resolutie van de SDS-PAGE minder, wel of geen denaturatie is geen reden

#11

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 maart 2008 - 17:52

:cry: 2 maal dezelfde post

Veranderd door Gerard, 29 maart 2008 - 17:53


#12

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 maart 2008 - 17:55

Ok,

toch nog een vraag:

Je hoeft geen stacking gel te gebruiken maar dan is de resolutie van de SDS-PAGE minder, wel of geen denaturatie is geen reden


dit zeg jij en ik kan daar akkoord mee gaan, maar als je zegt dat geen denaturatie of wel denaturatie geen reden mag zijn om geen stackinggel te gebruiken, welnu als je dat zegt , dan zeg je toch ook dat wanneer ik wil scheiden zonder mijn eiwit te denatureren ik de stackinggel in het midden moet zetten en niet vlak onder een buffer?
(zoals je op de tekening kan zien: als ik de stackinggel vlak onder de + bufffer steek, zullen de - geladen eiwitten niet bepaald goed gescheiden worden...)


Verder: is ureum nu een stof die eiwitten denatureert of niet? In mijn cursus staat dat ureum eiwitten denatureert , maar verderop zegt men dat ureum een niet denaturerende buffer is 8-[
of bedoelt men met niet denaturerend buffer een buffer die de lading van het eiwit niet aanpast?

#13

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 29 maart 2008 - 18:24

Kijk eens op deze link
http://www.ruf.rice....Talks/Talk3.htm

Ik heb het item nog eens door gelezen en zie dat ik een aantal zaken niet goed heb neergezet/opgemerkt. :oops:

1. SDS-Page is altijd denaturend, je kunt wel kiezen tussen reducerend en niet reducerend

2 Bij SDS-PAGE zit de anode beneden en jij heb aangegeven dat deze boven zit., er moet dan sprake zijn van een andere vorm van elektroforese alhoewel ik niet begrijp wat de stacking gel dan in het plaatje doet.

#14

lucilius

    lucilius


  • >250 berichten
  • 254 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 29 maart 2008 - 18:30

Hallo,

Ik begrijp alles wat je zegt, maar jij focust altijd op sds.
Ik spreek meer in het algemeen.

Maar ik vrees dat jij me niet echt een antwoord kan geven daar jij enkel met stackingsgels gewerkt hebt met sds.

Mij gaat het om: het gebruik van stackinggels wanneer je NIET met sds werkt.

Ik vermoed dat jij wel gelijk hebt en dat de stackinggel enkel gebruikt wordt wanneer je met sds werkt (of een andere buffer die ladingen aanpast).

Het probleem is dus gewoon dat het in mijn cursus niet goed uitgelegd staat.
Vandaar mijn vragen betreffende de onduidelijkheid.

#15

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 01 april 2008 - 08:02

Ik heb mezelf altijd als electroforese deskundige beschouwd, maar ik kan hier de discussie niet helemaal volgen. Ik heb ook het idee dar er een aantal dingen door elkaar heen gehaald worden.

De meest gebruikte methode is SDS-PAGE volgens Laemmli. Eiwitten worden gedeantureerd (meestal door verhitten icm SDS, and een reducerend reagens, bv. DTT of mercapto ethanol). Onder deze voorwaarden zijn alle eiwitten gedenatureerd en binden SDS (ca. 1.4 g SDS/g eiwit) en hebben daardoor alle dezelfde negatieve lading. Scheiding kan dan plaats vinden op (relatieve) grote door de zeefwerking van de polyacrylamide matrix. Een zogenaamde stacking gel (grote porien, lagere pH) zorgt er voor dat de eiwitten als een sterk geconcentreerde band de scheidingsgel bereiken.

Daarnaast is er non-denaturende electroforese. Dit wordt voornamelijk gebruikt om intakte eiwit complexen te analyseren. Belangrijk hierbij is dat de eiwitten geladen zijn, stabiel zijn en oplosbaar blijven tijdens de elecroforese. Er zijn verschillende uitvoeringen van non-denaturende electroforese, waarbij ureum gebruikt kan worden, maar ook buffer systemen met verschillende pH's. Er zijn systemen waarbij zure bufferes gebruikt worden en daardoor in feite anode en kathode gewisseld worden. In totaal zijn meerd an 4000 buffer systemen gepubliceerd.

Zie verder Gel Electrophoresis of Proteins (A practical approach) by B.D. Hames.

sjouke





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures