Springen naar inhoud

HPLC - reversed phase


  • Log in om te kunnen reageren

#1

SuikerSpin787

    SuikerSpin787


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 april 2008 - 14:32

Hallo,

Afgelopen week heb ik een HPLC uitgevoerd. Hierbij willen we het gehalte benzoezuur, salicylzuur en sorbinezuur gaan bepalen in monsters en standaarden. We hebben twee monsters gebruikt: Lipton ice tea en "Salsa drank" (soort breezer). We hebben de volgende standaarden gebruikt: benzoezuur, salicylzuur, sorbinezuur en een interne standaard (3-hydroxybenzoezuur). We hebben mengsels van deze standaarden gemaakt met de concentraties: 10 mg/l, 20 mg/l en 30 mg/l.

We vonden bij elk monster en elke standaard 4 pieken.
Bij de berekeningen heb ik alle retentietijden bepaald en heb ik van elke werkstandaard de volgende quotienten bepaald: trSalicylzuur/trI.S. Zo heb ik dit ook gedaan voor benzoezuur en sorbinezuur. Vervolgens wordt er gevraagd om bij elk monster de quotienten van de gevonden pieken en de interne standaard te bepalen (trPiek1/trI.S. enz.). Hierbij moet dus de trI.S. = trInterneStandaard bepaald worden in de chromatogrammen van de monsters. Ook moeten alle andere componenten bepaald worden in de monsters (piek 1 t/m 3).

Mijn vraag is: hoe bepaal je dit? Ik heb de pieken en retentietijden (en quotienten) van de monsters vergeleken met die van de standaarden, maar deze komen niet helemaal overeen. Bovendien is het onbekend wat er in de monsters zit.
Het lijkt me waarschijnlijk dat 3-hydroxybenzoezuur (interne standaard) als eerste van de kolom komt, daarna salicylzuur, dan benzoezuur en als laatste sorbinezuur.
Omdat de interne standaard het meest polair is en sorbinezuur apolair.

Ook moet ik de gehaltes van de componenten bepalen (monsters en standaarden).
Is het dan beter om de piekhoogtes te bepalen? (opmeten in mm's) of om het oppervlak van elke piek te bepalen?

Ik hoop dat jullie me kunnen helpen. HPLC heb ik namelijk nog niet eerder uitgevoerd.

groetjes Jennifer

Veranderd door SuikerSpin787, 07 april 2008 - 20:24


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Jooken

    Jooken


  • >250 berichten
  • 677 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 april 2008 - 15:12

Als alle exeprimentele parameters constant blijven moet de retentietijd van een bepaalde component constant blijven. Voor je twee monsters en 3 standaarden moet je dus 4 pieken vinden bij telkens dezelfde retentietijd.

Waarom je verhoudingen van retentietijden moet maken is mij niet erg duidelijk.

De hoeveelheden bepaal je door de piekoppervlakte van elke component te delen door de piekoppervlakte van de interne standaard. Je maakt nu een plot van

opp Component
-------------------
opp IS

als functie van de concentratie Component.

Bij de onbekenden bepaal je ook weer de verhouding van de piekoppervlaktes, en via de ijkcurve kan je de concentraties bepalen.

Wat de elutievolgorde betreft heb je in principe gelijk. Toch moet je altijd voorzichtig blijven. In de praktijk controleer je de retentietijden door je standaarden ook ťťn voor ťťn te injecteren, en de retentietijden te noteren.

Als je retentietijden niet constant zijn, is de meest waarschijnlijke oorzaak de samenstelling vna de mobiele fase. Relatief sterke zuren zoals jouw componenten vereisen een mobiele fase die goed gebufferd is op een pH van rond 2,5. Een typische bufferconcentratie is bvb 50 mM. Fosfaat is hier een geschikte buffer.

Hopelijk helpt dit een beetje.

#3

SuikerSpin787

    SuikerSpin787


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 april 2008 - 19:46

Bedankt.
De retentietijden zijn helaas niet constant. We hebben gebruik gemaakt van een mobiele fase die bestaat uit: 450 ml methanol, 550 ml gelfiltreerde aqua dest., 1 ml ijsazijn en 0,5 gram Na-acetaat.3H2O.
Ik heb de ijklijnen gemaakt van de standaarden en deze zien er aardig goed uit.
Er is alleen nog een ander probleem. De pieken van de monsters zien er anders uit dan die van de standaarden. Sommige zijn heel klein en andere liggen ver uit elkaar. Ik heb de oppervlakte quotienten van de monsters berekend en deze zijn groot in vergelijking met die van de standaarden.
Het wordt dan erg lastig om de concentraties van de componenten in de monsters te bepalen m.b.v. de ijklijnen. Het kan wel, maar dan zijn de gehaltes van sommige componenten in de monsters abnormaal hoog (50 - 60 mg/L)
Hoe zou ik dit het beste kunnen doen?

groetjes Jennifer

Veranderd door SuikerSpin787, 07 april 2008 - 20:23


#4

bteunissen

    bteunissen


  • >1k berichten
  • 1122 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 april 2008 - 10:58

De pieken van de monsters zien er anders uit dan die van de standaarden. Sommige zijn heel klein en andere liggen ver uit elkaar.

Eerst een vraag voor jou: is de matrix van je standaarden dezelfde als van de monsters op het moment dat je ze injecteerd?

#5

Napoleon1981

    Napoleon1981


  • >1k berichten
  • 2399 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 09 april 2008 - 03:05

Je zult je monsters echt op een ijklijn moeten leggen. Als je niet ijken kan is er natuurlijk iets vreemds aan de hand. Het feit dat je pieken er raar uit zien betekend dat je minstens 1 andere component met een zelfde retentie hebt. Heb je wel eens een blanco van je matrix geinjecteerd?

Er zijn hier een heleboel dingen fout gegaan in je experiment (niet zo gek, want het is pas je eerste keer), nog een paar opmerkingen om je op het juiste pad te zetten:

Standaarden dien je 1 voor 1 te injecteren en zo de retentietijd van iedere componend te bepalen. Zomaar met de natte vinger de pieken benoemen op polariteit is een hele risico volle business. Ik kan je een aantal voorbeelden geven waar je echt de mist in gaat.

Als je retentie tijd erg verandert, dan is het waarschijnlijk een andere stof.

Is een concentratie van 50mg/L wel abnormaal hoog? Heb je een referentie waarde? Als je monster buiten het bereik van een ijklijn valt kun je het altijd verdunnen en nog een keer injecteren.

Veranderd door Napoleon1981, 09 april 2008 - 03:07


#6

SuikerSpin787

    SuikerSpin787


  • 0 - 25 berichten
  • 3 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 09 april 2008 - 10:31

@bteunissen: Sorry, maar ik snap je vraag niet helemaal. HPLC is bij ons nog niet veel aan de orde gekomen.

Ik heb dus geen blanco's geinjecteerd, alleen standaarden (10,20 en 30 mg/L) die benzoezuur, salicylzuur, 3-hydroxybenzoezuur (I.S) en sorbinezuur bevatten.
De retentietijden heb ik nog wat beter bekeken, en bij de monsters is er wel een component die als eerste van de kolom komt met dezelfde retentietijd als bij de standaarden. Bij de standaarden is dat 3-hydroxybenzoezuur en ik denk dat dit dan ook bij de monsters als eerste van de kolom komt. De retentietijden van de andere drie pieken bij de monsters komen niet overeen met die van de standaarden.

Ik denk ook dat er veel dingen fout zijn gegaan.
De standaarden zijn een voor een geinjecteerd en de retentietijd is steeds bepaald. Ook heb ik de monsters op de ijklijnen gezet en deze vallen er bijna allemaal buiten. Er zijn wel enkele waarden die op de ijklijn vallen en die beneden de 50 mg/L vallen.

We hebben de monsters niet verdund, volgens de practicum docent was dit niet nodig. Zelf denk ik achteraf dat dit wel nodig was geweest.
Ik weet verder niet wat er in de monsters zit. We hebben geen referentiewaarden gekregen. Ik heb wel op de verpakking van Lipton Ice tea gekeken, er wordt wel ascorbinezuur (vit.C) gebruikt als antioxidant. Maar natuurlijk staan er geen concentraties op. Op de verpakking van het andere monster heb ik niets kunnen vinden. Het is ook heel goed mogelijk dat er sorbaten en benzoaten zijn gebruikt als conserveermiddel.
Ik heb al veel op internet gezocht en over het algemeen is een gehalte van >20 mg/L al hoog.

#7

drune134

    drune134


  • >250 berichten
  • 873 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 11 april 2008 - 06:55

Wanneer er sorbinezuur en/of benzoŽzuur (of de zouten ervan) in een voedingsmiddel zit moet dit op het etiket vermeld worden. Wanneer er niets van vermeld is wil dat niet altijd zeggen dat het er ook niet in zit. Zoek eens naar produkten waar benzoŽzuur en/of sorbinezuur op het etiket vermeld staan en ga die onderzoeken.

succes





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures