Springen naar inhoud

affiniteit van antilichamen


  • Log in om te kunnen reageren

#1

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2008 - 16:08

Als je nu bv een antilichaam koopt gericht tegen CD4 hoe kan je dan de affiniteit bepalen van dat antilichaam. Dus hoe sterk hij wel bindt.
En ook hoe kun je de specificiteit bepalen, dat hij bv alleen aan CD4 bindt en niet aan andere oppervlaktemerkers.
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 24 mei 2008 - 18:43

Antilichamen worden gemaakt door bijvoorbeeld CD4 eiwitten in te brengen in een dier. Het dier maakt antilichamen tegen deze eiwitten en vervolgens worden ze gewonnen uit het bloed van het dier. Door het dieren meerdere malen te injecteren met het eiwit wordt de antilichaam productie hoger dus haal je er meer specifieke antilichamen uit. Vervolgens kun je deze antilichamen gebruiken voor biochemische experimenten. Deze antilichamen zijn dus specifiek. Natuurlijk werkt niet elk antilichaam even goed, dus zou je met behulp van een reeks van verdunningen achterhalen bij welke verdunning hij het beste werkt. Om aspecifieke bindingen te voorkomen kun je antilichamen opschonen. Voorbeeld van opschonen: Antilichamen mengen met cellen die je gebruikt. De aspecifieke antilichamen binden zich en de specifieke zullen zich ook wel wat binden maar daar heb je wel meer van.

MvG Ron

#3

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 24 mei 2008 - 20:20

Affiniteit kun je meten door te kijken hoeveel van een antigeen/antilichaam binding wordt verbroken door bv 8M urea in een ELISA test.
Specificiteit kun je beoordelen door in een western blot een sample naast een een puur CD4 sample te electroforeren, vindt je in je sample meer banden dan in je CD4 laan dan zijn er andere antilichamen aanwezig.

#4

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2008 - 21:05

Affiniteit kun je meten door te kijken hoeveel van een antigeen/antilichaam binding wordt verbroken door bv 8M urea in een ELISA test.
Specificiteit kun je beoordelen door in een western blot een sample naast een een puur CD4 sample te electroforeren, vindt je in je sample meer banden dan in je CD4 laan dan zijn er andere antilichamen aanwezig.

Moet je bij de ELISA test de binding dan al laten gebeuren en pas daarna het urea toevoegen?
Is dit dan ook gewoon door bij de verdunningsreeks een zelfde hoeveelheid urea te doen, of moet die ook variŽren?

Bij de western blot begrijp ik niet goed wat je doet. Als je een western blot doet om CD4 aan te tonen zal u AL toch alleen binden met CD4, tenzij het andere eiwitten herkent, en dan zul je meerdere banden zien, maar daarom toch niet meer AL?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#5

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 mei 2008 - 21:09

Antilichamen worden gemaakt door bijvoorbeeld CD4 eiwitten in te brengen in een dier. Het dier maakt antilichamen tegen deze eiwitten en vervolgens worden ze gewonnen uit het bloed van het dier. Door het dieren meerdere malen te injecteren met het eiwit wordt de antilichaam productie hoger dus haal je er meer specifieke antilichamen uit. Vervolgens kun je deze antilichamen gebruiken voor biochemische experimenten. Deze antilichamen zijn dus specifiek. Natuurlijk werkt niet elk antilichaam even goed, dus zou je met behulp van een reeks van verdunningen achterhalen bij welke verdunning hij het beste werkt. Om aspecifieke bindingen te voorkomen kun je antilichamen opschonen. Voorbeeld van opschonen: Antilichamen mengen met cellen die je gebruikt. De aspecifieke antilichamen binden zich en de specifieke zullen zich ook wel wat binden maar daar heb je wel meer van.

MvG Ron

Dat weet ik wel dat dat in dieren gemaakt word enzoverder... maar wat ik mij afvroeg als je zulke antilichamen aankoopt/ofja opwekt in dieren (doet er nu niet toe) kan er dan kruisreactie optreden met andere antigenen en hoe kun je dat precies bepalen? Door affiniteit en specificiteit te bepalen.

Wat ik dus eigenlijk wil weten is het antilichaam tegen CD4 dat ik aankoop wel degelijk gericht tegen CD4 en niet tegen iets anders. Hoe kan ik controleren of dit wel specifiek is?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#6

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 24 mei 2008 - 21:29

[Moet je bij de ELISA test de binding dan al laten gebeuren en pas daarna het urea toevoegen?
Is dit dan ook gewoon door bij de verdunningsreeks een zelfde hoeveelheid urea te doen, of moet die ook variŽren?

Bij de western blot begrijp ik niet goed wat je doet. Als je een western blot doet om CD4 aan te tonen zal u AL toch alleen binden met CD4, tenzij het andere eiwitten herkent, en dan zul je meerdere banden zien, maar daarom toch niet meer AL?

Je laat je monster binden aan de anti-CD4 en vervolgens incubeer je met verschillende hoeveelheden 8M urea (of een ander chaotroop reagens) en vervolgens maak je de ELISA af. De hoeveelheid urea die je nodig hebt waarbij je nog 50% binding over hebt van wat het monster zonder urea bindt is dan een maat voor de affiniteit.
Dit is voor zover mijn kennis reikt. Ik heb er in de praktijk niet mee gewerkt en heb mijn handboeken niet bij de hand om het verder na te kijken.

Het patroon van de westernblot van het sample zal indentiek zijn als dat van CD4 zelf, als je meer banden vindt dan betekent dat dat je antistof ook andere epitopen in je sample herkent die niet zijn toe te wijzen aan je CD4

Veranderd door Gerard, 24 mei 2008 - 21:53


#7

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2008 - 08:22

[Moet je bij de ELISA test de binding dan al laten gebeuren en pas daarna het urea toevoegen?
Is dit dan ook gewoon door bij de verdunningsreeks een zelfde hoeveelheid urea te doen, of moet die ook variŽren?

Bij de western blot begrijp ik niet goed wat je doet. Als je een western blot doet om CD4 aan te tonen zal u AL toch alleen binden met CD4, tenzij het andere eiwitten herkent, en dan zul je meerdere banden zien, maar daarom toch niet meer AL?

Je laat je monster binden aan de anti-CD4 en vervolgens incubeer je met verschillende hoeveelheden 8M urea (of een ander chaotroop reagens) en vervolgens maak je de ELISA af. De hoeveelheid urea die je nodig hebt waarbij je nog 50% binding over hebt van wat het monster zonder urea bindt is dan een maat voor de affiniteit.
Dit is voor zover mijn kennis reikt. Ik heb er in de praktijk niet mee gewerkt en heb mijn handboeken niet bij de hand om het verder na te kijken.

Het patroon van de westernblot van het sample zal indentiek zijn als dat van CD4 zelf, als je meer banden vindt dan betekent dat dat je antistof ook andere epitopen in je sample herkent die niet zijn toe te wijzen aan je CD4

Dus als ik het goed begrijp zit op je ELISA plaat CD4 en voeg je je antilichaam toe. Dus dit moet je dan niet met een titratiereeks doen? Enkel het urea moet je in verschillende concentraties toevoegen?

Voor de Western blot analyse heb je dus een staal nodig met CD4 en andere oppervlakte eiwitten. Hoe kan ik die verkrijgen uit mijn cel?
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#8

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 25 mei 2008 - 08:56

Sorry ik kan je niet verder helpen het wordt te specifiek voor mij en ik zou moeten gaan raden want ik heb geen ervaring met celkweken en oppervlakteeiwitten van cellen. Ik denk dat je eens de bibliotheek in moet gaan en de handboeken raadplegen.

#9

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 mei 2008 - 12:10

Als ik het goed begrijp koop je dit antilichaam bij een bedrijf? Vertrouw je het antilichaam niet dan? Heb je het al getest?
Als het goed is hebben ze daarbij een bijsluiter geleverd en volgens mij staat er ook in waarmee hij een crossreactie aangaat.

MvG Ron

#10

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2008 - 12:23

ik moet mijn thesis verdedigen, en idd we kopen die antilichamen. Maar een vraag die ze mij waarschijnlijk gaan stellen is : hoe kun je controleren dat het antilichaam specifiek is voor CD4 en niet op iets anders bindt. Bijsluiters heb ik niet meer binnen handbereik, het is namelijk tegen morgen
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#11

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 mei 2008 - 12:35

Bij een western blot lyseer je de cellen en vervolgens denatureer je de eiwitten en run je ze op gel. Hoe dit precies werkt kunnen je makkelijk vinden op het net. Vervolgens breng je het antilichaam erop en zie je of het een duidelijke band heeft bij het CD4 eiwit.
Succes.

MvG Ron

#12

mochila

    mochila


  • >100 berichten
  • 166 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2008 - 12:39

is dit de enige methode om het te controleren? Want als je cellen lyseert, heb je ook eiwittene die intracellulair zitten mee, en die kunnen met het antilichaam binden, maar zijn dan eigenlijk niet van belang voor flow cytometrie. Bestaat er een methode om enkel de extracellulaire eiwitten te bekijken?
Bedankt al voor de moeite :)
“Twenty years from now you will be more disappointed by the things that you didn't do than by the ones you did do. So throw off the bowlines. Sail away from the safe harbor. Catch the trade winds in your sails. Explore. Dream. Discover.”

#13

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 25 mei 2008 - 13:08

Heb je ook een cel toestand waarin deze CD4 eiwitten niet voorkomen? Dan kun je gewoon een negatieve controle meenemen. Dan heb je twee populaties cellen. Misschien kun je een deletie maken van deze stam? Als je dan geen binding hebt op je cel dan weet je dat CD4 specifiek is.

MvG Ron

#14

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 mei 2008 - 13:45

RNAi of overexpressie toepassen is ook een goede methode, vooral als je geen cellijn hent die het eiwit niet tot expressie brengt.
Zie je bij deze experimenten de banden sterker of zwakker worden, dan kun je er van uit gaan dat je een specifiek antilichaam hebt.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures