Springen naar inhoud

GFP opzuiveren


  • Log in om te kunnen reageren

#1

fiene_CF

    fiene_CF


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 02 december 2008 - 19:34

hallo

Wij moeten als project het GFP gen opzuiveren uit een E.coli bacterie. We hebben reeds schudculturen aangemaakt en nadien gecentrifugeerd. De bekomen pellets zitten nu in de dieprvies.

De opdracht is dus om GFP uit de plasmide van E. coli te halen en op te zuiveren.
Ik dacht dat dit misschien gewoon kon door omgekeerd te werk te gaan als bij het transformeren van de E. coli bacterie.

Nu weet iemand soms een site of zoekmachine die mij verder op weg kan helpen om een degelijke procedure samen te stellen

Alvast dank

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 03 december 2008 - 13:49

Als je het DNA wilt opzuiveren, zoek dan op plasmid purification op google of op
protocol-online.org

http://www.protocol-...__Purification/

Veranderd door Roy van Heesbeen, 03 december 2008 - 13:49


#3

Pink Panther

    Pink Panther


  • >250 berichten
  • 516 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 03 december 2008 - 19:23

Aangezien een natuurlijk E. coli niet in staat is om het GFP te produceren, hebben jullie dat er zelf ingestoken d.m.v. een plasmide. Je hebt restrictieknipplaatsen gebruikt om het GFPconstruct in de plasmidevector te krijgen, dus de kans is groot dat je dezelfde restricteknipplaatsen nu kan gebruiken om het stukje DNA er weer uit te knippen. En dan met PCR vermenigvuldigen zodat je een opzuivering krijgt.

#4

fiene_CF

    fiene_CF


  • 0 - 25 berichten
  • 2 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 03 december 2008 - 20:26

Dankjewel allemaal nu kannek al wat verder

=)

#5

Roy van Heesbeen

    Roy van Heesbeen


  • >250 berichten
  • 740 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 december 2008 - 11:56

@ Pink Panther
E.coli kan wel degelijk GFP tot expressie brengen als je de juiste promoter gebruikt. De expressie waarden zijn zelfs zo hoog dat je kolonies groen worden zonder ze aan te stralen met blauw licht.

#6

bcbt

    bcbt


  • 0 - 25 berichten
  • 5 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 07 december 2008 - 14:50

Ik snap wel niet waarom je een e coli zou transformeren met het GFP gen om het daarna weer uit te zuiveren.
Je kan toch ook gewoon van de eerste keer PCR doen.

Ik zou denk dat men een GFP gen in E coli zou brengen om daarna het GFP eiwit eruit te zuiveren.

Maar ja, ik weet natuurlijk niet wat de proef exact is.

#7

Pink Panther

    Pink Panther


  • >250 berichten
  • 516 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 08 december 2008 - 13:07

@ Roy van Heesbeen

Ja, tuurlijk kan E. coli het GFP ter expressie brengen, als je maar de juiste promotor er aan hangt. Maar ik bedoelde dat er voor zover ik weet geen stammen van E. coli zijn die van nature een GFP-gen hebben (dus zonder dat de mens het erin gestoken heeft).
Want dat is nu juist wat je wil bereiken, hoe groener de kolonie ziet, hoe meer GFP (en dus ook hoe meer product van het gekoppeld gen, wat je wil onderzoeken) er gemaakt wordt. Als de E. coli van nature ook een secundair GFP-gen zou bevatten, zou je ook die opnemen in je meting en natuurlijk een zware overschatting maken van het expressieniveau van het gekoppeld gen.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures