Springen naar inhoud

pcr-sscp - fenol/chloroformextractie


  • Log in om te kunnen reageren

#1

Rockndoll

    Rockndoll


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 23 december 2008 - 10:12

Hallo Leute, ik ben bezig met het opzetten voor de pcr-sscp methode voor mijn stageplaats. De pcr reactie is redelijk standaard (met Instagene Matrix), maar voor dit onderzoek wil ik gebruik maken van enkelstrengs DNA. Dit doe ik door na het pcr-en Lambda Exonuclease toe te voegen. Hierna is het de bedoeling om het restant eiwit te verwijderen d.m.v. fenol/chloroform extractie. Ik heb dit nu al 3x gedaan en alle 3 de keren strandde dit op hetzelfde punt. Na de wasstap met chloroform voeg ik 10Ķl natrium-acetaat toe en 250Ķl ethanol voor het binden van het DNA. Na 10 minuten in een ijsbad en centrifugeren hoor ik dan een pelletje onderin te krijgen met het DNA en een supernatant daarboven. Ik krijg alleen die DNAneerslag maar niet! Ik heb de pH van de phenol/chloroform al omhoog gebracht (bij lage pH gaat het RNA bovenin het epje zitten en het dna onderin, bij hoge pH precies andersom) en de stap van het natrium-acetaat was vergeten, maar de neerslag komt maar niet. Zou het zo kunnen zijn dat natrium-acetaat geen grip heeft op enkelstrengs dna? Of dat mijn enkelstrengs dna verdwijnt door de phenol/chloroform wasstappen? Kortom: Heeft iemand ervaring met deze techniek?
Alvast bedankt!

Veranderd door Rockndoll, 23 december 2008 - 10:13


Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 23 december 2008 - 23:49

Maar ga je niet eerst zuiveren van eiwitten voordat je de pcr inzet? dan weet je zeker dat er DNA overblijft. Misschien werkt deze methode niet goed voor enkelstrengs omdat het misschien anders werkt dan dubbel. Al over nagedacht om af te draaien? Misschien is er weinig neerslag zichtbaar omdat de hoeveelheid DNA is te laag is.

MvG Ron

#3

Rockndoll

    Rockndoll


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 december 2008 - 09:05

ik haal de bacteriŽn (pure kolonies) rechtstreeks van een PCM plaat (1 nacht op 30 graden). Ik haal wat kolonies eraf, instagene matrix erbij volgens protocol en vervolgens PCR, dus het is sowieso zuiver DNA. Hierna ga ik aan de slag met de Qiaquick PCR purification kit, de lambda exonuclease en vervolgens de fenol/chloroform-wasstappen. Nu ik dit typ, zit ik te denken over de Qiaquick PCR purification kit; aangezien ik al 'schoon' DNA heb is die stap nu misschien helemaal niet nodig? Later ga ik met onzuivere producten werken, dus dan is het wel noodzakelijk, maar nu ben ik puur de methode aan het testen. En ik las in de handleiding van Instagene Matrix dat het "een snelle en makkelijke manier is om DNA klaar te maken voor PCR. Hierbij wordt er voor gezorgd dat de intensieve phenol/chloroform extractie stappen niet meer nodig zijn. Dit komt doordat de matrix de cel lysis producten die het PCR amplificatieproces verstoren, absorbeert. " Maar na mijn behandeling met Lambda Exonuclease hou ik dNTPs over die -naar mijn mening- verwijderd worden met de fenol/chloroform-wasstappen... 8-[ I'm lost now... Help?

#4

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 30 december 2008 - 12:02

dNTPs hoef je echt niet te verwijderen hoor. Dit zijn losse A,T,G,C en die hebben geen invloed. Deze hou je altijd over na een PCR reactie net als wat van buffers en ezymen. Advies hou je aan het protocol van de fabrikant en voeg geen wassen stappen toe als zij het niet nodig vinden.

MvG Ron

#5

Rockndoll

    Rockndoll


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 30 december 2008 - 13:13

Krijg ik dan geen smeer of iets dergelijks in mijn gel te zien als ik de dNTPs niet verwijder? Want als het verder geen invloed heeft, kan ik de wasstappen met fenol/chloroform en chloroform dus gewoon weglaten... (zijn bedoeld om eiwitten te verwijderen)

#6

biochemiefreak

    biochemiefreak


  • >1k berichten
  • 2330 berichten
  • VIP

Geplaatst op 30 december 2008 - 19:23

dNTPs zorgen volgens mij niet echt voor smeer op je gel.
Je kunt trouwens toch vrij makkelijk een gelletje runnen met verschillende fracties dan weet je precies hoe het er uit zit.
Een gel is zo gemaakt. Laat je ook gelijk je probleem zien als je ergens tegen aan loopt.

MvG Ron

#7

Rockndoll

    Rockndoll


  • 0 - 25 berichten
  • 14 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 05 januari 2009 - 10:40

De gelen zijn wel aanwezig, dat is het probleem niet. Ik behoor voor de electroforese-stappen een witte neerslag (mijn ssDNA) te krijgen, welke ik moet verdunnen met TE buffer, loading buffer etc. Die witte neerslag krijg ik maar niet, alles blijft in oplossing (of het DNA is spontaan verdwenen). Zolang ik die witte pellet niet krijg, kan ik niet verder werken lijkt mij, want dan heb ik gewoon een oplossing van fenol/chloroform met natriumacetaat met evt wat DNA en dat kan ik niet zomaar op een gel zetten natuurlijk. Maar ik ga deze week weer een nieuwe run doen, heb wat kleine aanpassingen gemaakt in het protocol en zal zien of het nu misschien wel werkt (meer DNA product in de PCR, en misschien de fenol/chloroform stappen skippen). Hoe dan ook: ik hou jullie op de hoogte!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures