Springen naar inhoud

Elisa


  • Log in om te kunnen reageren

#1

ewout1609

    ewout1609


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 24 april 2009 - 08:49

Hallo,

Op het werk hebben wij enige tijd problemen met ELISA. Ik hoop dat iemand mij tips kan geven. Het gaat om het volgende:

Bij het meten van de ELISA hebben wij een ijklijn met de volgende OD:

Std. 1 2.347 - 2.305 (duplo)
Std 2. 2.296 - 2.343
Std 3. 1.770 - 2.262
Std 4. 2.277 - 2.273
Std 5. 2.194 - 2.293
Std 6. 1.667 - 1.668
Std 7. 1.035 - 1.027
Std 8. 0.497 - 0.452
Std 9. 0.242 - 0.241
Std 10. 0.114 - 0.119

De eerste standaarden kloppen niet qua meting. Het gaat om een ijklijn die doorverdund is dus theoretisch kan dit niet.

De Elisa ziet er als volgt uit:
- Platen worden gecoat met een capture-antibody verdund in een coating buffer. Hiervan wordt 100 ul op een plaat gepipetteerd en een nacht geincubeerd.
- Vervolgens wordt de plaat gewassen met PBS-T.
- 200 ul 1 % BSA in PBS-T wordt gepipetteerd en geincubeerd gedurende 1,5 uur bij 25 graden.
- De plaat wordt gewassen met PBS-T.
- 100 ul monster, verdund in 1% BSA, wordt gepipetteerd en geincubeerd gedurende 1,5 uur bij 25 graden.
- De plaat wordt gewassen met PBS-T.
- 100 ul biotine (1:1000) wordt gepipetteerd en geincubeerd gedurende 1,5 uur bij 25 graden.
- De plaat wordt gewassen met PBS-T.
- 100 ul streptavidin-HRP (1:2000) wordt gepipetteerd en geincubeerd gedurende 0,5 uur 25 graden.
- De plaat wordt gewassen met PBS-T.
- 100 ul ABTS-substraat pH 4,0 wordt gepipetteerd.
- De plaat wordt afgelezen.

Ik hoop dat jullie advies kunnen geven.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 24 april 2009 - 09:01

Kun je meer vertellen over de geschiedenis van de test?
Zoals heeft deze gewerkt in het verleden, zijn er zaken veranderd?
Temperatuur, leverancier etc.
Welk eiwit wordt bepaald
De standaarden worden deze doorverdund of zijn het seperate flesjes?
Zoals de getallen er nu uit zien lijkt het er op dat standaard 1 t/m 4 op het plateau zijn beland, mogelijkheden zijn te lage concentraties/activiteit van de antistoffen, streptavidine of ABTS.

#3

ewout1609

    ewout1609


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 april 2009 - 11:43

Temperatuur, leverancier etc. deze punten zijn niet veranderd. Het enige wat veranderd is dat de ijklijn eerst bij 125 ng/ml begon en sinds het probleem bij 250 ng/ml. De standaarden worden doorverdund. We hebben het al handmatig verdund en met een verdunningsapparaat, maar dit maakt geen verschil. Het eiwit dat bepaald wordt is dierlijk maar verder kan ik hier niks over vermelden.

We hebben verschillende verdunningen steptavidine getest maar dit maakt ook geen verschil.

#4

*_gast_Gerard_*

  • Gast

Geplaatst op 28 april 2009 - 12:28

Ik vermoed dat jullie met een setje werken (for research only) en het probleem kan dan in het lotnummer zitten waarbij ineens de extincties veel hoger uitpakken.
Als ik naar de resultaten kijk zou je kunnen proberen met 50 ul monster en 20 minuten incubatie met ABTS. Als de hoogste standaard dan een E krijgt van 2,0-2,2 dan moet de ijklijn weer bruikbaar zijn.
In ieder geval houdt moed want meestal komt het vanzelf op de een of andere manier weer in orde. Problemen met een lopende ELISA-test zijn zeer moeizaam op te lossen en kunnen zeer frusterend zijn. Helaas spreek ik uit ervaring. :cry:

#5

ewout1609

    ewout1609


  • 0 - 25 berichten
  • 9 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 april 2009 - 14:25

Is goed we zullen het proberen. Bedankt voor de hulp!!





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures