Springen naar inhoud

Bandjes OK, achtergrond SLECHT.


  • Log in om te kunnen reageren

#1

gbow

    gbow


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 12 mei 2009 - 18:40

Hallo Allemaal,

Als eindproject voor school moeten we een protocol schrijven over hoe je de eiwitten van eiwit (egg white), runderserum, spinazie en whey (melk serum) kunt isoleren en scheiden dmv een gel electroforese. ook moesten we een ijklijn maken met BSA-verdunning op een gel, en dan in een grafiek de molecuulmassa uitzetten tegen de hoeveelheid cm's die de eiwitten gelopen hebben in de gel.

Voor de electroforese hebben we kant-en-klare 10% TRIS-HCL gels gebruikt van Bio-Rad. Geladen met 2 markers, 25, 50, 75 en 100 g eiwitten uit BSA en 1:1 egg white, 1:1 runderserum, 1:1 melk serum en een hoeveelheid spinasiextracten in extractiebuffer.

De gel heeft anderhalf uur gelopen bij 100 Volts, de mA zat gemiddeld rond de 250. Daarna hebben we de gel gefixeerd met fixeerbuffer (5 delen methanol, 1 deel azijnzuur en 4 delen ddwater) voor 5 - 10 minuten. Daarna hebben we de gel gestained met Coomassie Blue (puur) en ontkleurd met dezelfde fixeerbuffer voor 10 minuten.

Dit zijn de resultaten:
Foto's


De bandjes zien er opzich niet slecht uit, misschien een beetje licht. Maar de achtergrond daarintegen is veel te sterk, en er zitten veel vage vegen op. Hoe kunnen we zorgen dat we een lichtere achtergrond krijgen, en hoe voorkomen we zo'n vegen op de gel. Wat veroorzaakt deze vegen? Als iemand dit eerder heeft gezien, of als iemand denkt te weten wat er mis kan zijn. post a comment, please.

Heel erg bedankt!

ps. momenteel liggen de gells in de fixeerbuffer voor meer ontkleuring gedurende de nacht. Ik zal de resultaten hiervan morgen posten.

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

gbow

    gbow


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 13 mei 2009 - 09:44

Na de gels 1 nacht in ontkleuringsoplossing te laten liggen krijgen we de volgende resultaten:

Foto BSA

Foto samples

De achtergrond is dus weg, maar de donkere vege zijn nog steeds aanwezig. Kan dit liggen aan de destaining methode?

Groeten,

Rob

#3

Hovinsj1

    Hovinsj1


  • >100 berichten
  • 125 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 13 mei 2009 - 14:58

Hoi,

De gelen zijn zeer overbeladen. Voor een normale kleuring met Coomassie is 10 tot 20 g (totaal) eiwit meer dan genoeg. Met een goede (colloidale) Coomassie kleuring is zo'n 20 ng eiwit per band te detecteren. Dus doordat je gel volledig overbeladen is, is de scheiding niet erg goed en zie je veel achtergrond.

ook moesten we een ijklijn maken met BSA-verdunning op een gel, en dan in een grafiek de molecuulmassa uitzetten tegen de hoeveelheid cm's die de eiwitten gelopen hebben in de gel

Als je de BSA verdund, zul je precies dezelfde migratie afstanden vinden voor het eiwit, je kunt eventueel de intensiteit van ieder bandje meten en daarmee een ijkcurve opstellen. Je bent waarschijnlijk in de war met het opzetten van een ijklijn met eiwit markers. Dan kun je de migratie tegen de log MW uitzetten en daardoor van onbekende eiwitten de massa benaderen.

sjouke

#4

gbow

    gbow


  • 0 - 25 berichten
  • 8 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 13 mei 2009 - 17:22

heel erg bedankt! we zullen de samples verdunnen en het nog eens proberen. ik zal de resultaten morgen posten. wat de ijklijn betreft, ik zal het protocol nog eens goed doorlezen. ik heb het denk ik verkeerd begrepen. nogmaals bedankt. rob





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures