Springen naar inhoud

Single-cell gel elektroforese (komeettest)


  • Log in om te kunnen reageren

#1

CrimeScience

    CrimeScience


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 september 2009 - 17:32

Hallo,

Ik ben met mijn onderzoeksgroep begonnen, en ga de mate DNA degradatie onder invloed van licht (gloeilamp-TL-UV) bepalen. Dit ga ik doen door middel van de single-cell gel electrophoresis, oftewel de komeettest.

Hierbij gebruik je een agarosegel, en kun je dus TAE en TBE als buffer gebruiken. Ik weet niet zo goed welke ik het beste kan gebruiken, aangezien ik geen idee heb hoelang de fragmenten zullen zijn.

Ik weet dat TAE buffer ook gebruikt wordt bij een breed scala aan mutatie analyses, maar daarentegen is TBE weer uiter mate geschikt voor de analyse van DNA grootte.

Ik hoop dat een van jullie mij een advies of iets dergelijks kan geven.

Alvast bedankt!

Dit forum kan gratis blijven vanwege banners als deze. Door te registeren zal de onderstaande banner overigens verdwijnen.

#2

Mantanna

    Mantanna


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 25 september 2009 - 18:20

Ha Sharon,

Leuk onderwerp! En trouwens ook een erg interessante studie.

Is het niet handiger om de gel te skippen en je te verdiepen in de capilliaire electroforese? Dit wordt meer toegepast in de forensische laboratoria.

Ik weet dat deze op het Saxion beschikbaar is, want ik studeer er zelf ook. ;)

Hoe ziet je proefopstelling eruit? Misschien dat je na de DNA-isolatie van je monsters eerst kunt RealTime PCR'en om de concentratie DNA te bepalen.

Daarna de monsters amplificeren met de primers die op school aanwezig zijn. Volgens mij zijn dit TPOX, TH01, CSF1PO en nog een.

Tot slot gelelectroforese en aan het piekenpatroon af kunt leiden hoe het DNA is afgebroken.

Misschien is het ook een idee om meer plaats delict gerelateerd bezig te gaan? Bijvoorbeeld zonlicht en in een schaduw? In de literatuur is al bekend dat UV-licht DNA afbreekt.

#3

CrimeScience

    CrimeScience


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 25 september 2009 - 21:44

Capillaire elektroforese is inderdaad een meer gebruikelijke methode, alleen is de kans op slagen op het Saxion wel klein. Voor zover ik weet is er nog geen reproduceerbaar resultaat mee bereikt.

Daarnaast is SCGE nog niet eerder gedaan op school, en leek het ons daarom ook wel interessant op deze methode te proberen. Vandaar dat we dus voor deze methode hebben gekozen.

De reden voor de lichtbronnen die ik ga gebruiken ligt vooral, aan het feit dat je het monster gereguleerd kunt blootstellen. Voor zonlicht en schaduw zou ik de monster buiten moeten neerleggen, wat forensisch gezien wel interessant is, maar ook wel lastig over een langere periode.

Wat ik wil gaan doen is een bloedmonster blootstellen aan de lichtbron over een bepaalde periode. Vervolgens ga ik de leukocyten isoleren mbv Ficoll en centrifugeren. Omdat er ongeveer 5000 cellen per agarosegel in de agarose moet worden opgelost (geen idee of het ook daadwerkelijk 5000 moeten zijn, maar dit aantal werd genoemd in een artikel), zullen we mbv de sysmex het aantal leukocyten gaan tellen per ul. Dan kunnen we bepalen hoeveel ul we moeten oplossen in de agarose. De cellen gaan we mengen met de agarose.. en brengen de gel aan op een voorwerpglaasje. Vervolgens runnen we de gel, en kunnen we het resultaat bekijken onder de fluorescentiemicroscoop (uiteraard zullen we in de agarosegel dan ook een kleurstof moeten toevoegen als propidium iodide).

#4

Mantanna

    Mantanna


  • 0 - 25 berichten
  • 16 berichten
  • Gebruiker

Geplaatst op 27 september 2009 - 15:07

Ik heb me even verdiept in de methode die jullie gaan gebruiken. Klinkt interessant!

Wat betreft je allereerste vraag zou ik TBE buffer gebruiken. TBE bevat namelijk boor dat een remmende werking heeft op enzymen die DNA afbreken.

Je kan natuurlijk ook allebei de buffers gebruiken en zo bekijken welke buffer het beste resultaat geeft.

#5

CrimeScience

    CrimeScience


  • 0 - 25 berichten
  • 6 berichten
  • Ervaren gebruiker

Geplaatst op 28 september 2009 - 07:55

Bedankt voor je reactie.

Als we qua voorbereidingstijd nog tijd over hebben, dan kunnen we nog wel eerst gaan testen welke buffer het beste werkt, maar anders zullen we voor de TBE buffer gaan.





0 gebruiker(s) lezen dit onderwerp

0 leden, 0 bezoekers, 0 anonieme gebruikers

Ook adverteren op onze website? Lees hier meer!

Gesponsorde vacatures

Vacatures